(2)感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜(约24～28h)培养到OD值为0.8～1.0(约108 Cells/ml); 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min; 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管; 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体...

4）加入10ml， pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min 5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min 6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉...

基本原理是：用醋酸锂或其他金属离子（Na+，K+，Ca2+，Rb+等）处理对数生长期的细胞使之成为感受态，经热休克（Heat shock）处理，在PEG帮助下质粒DNA进入真菌细胞，形成转化子，一般要在分生孢子萌发后才进行。此法仅仅局限于少数种类的丝状真菌的遗传转化，例如，1984年Dhawale等对Neurospore crassa用L...

(2)感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜(约24～28h)培养到OD值为0.8～1.0(约108 Cells/ml); 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min; 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管; 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体...

这两个质粒都含有自发复制序列ARS，自发复制序列含有复制原点，使之能在酵母体内于染色体进行复制。醋酸锂法利用带有正电荷的锂离子中和细胞壁和质粒上的负电荷，转化混合物中的单链DNA将结合在细胞壁上，因而只剩质粒DNA能被酵母细胞摄取。然后利用突然增温，造成细胞内外压力差，在细胞壁上形成小孔让...

1.6 酵母感受态细胞的制备及质粒转化 酿酒酵母的质粒转化选用Gietz等(1992)的醋酸锂法。于30℃过夜培养5 ml酿酒酵母至OD600为0.5左右,扩大培养至50ml,再生长4h后,5000×g离心8min收集细胞。以20ml无菌水洗,然而把离心收集的酵母以10ml新配的LiAc溶液100mmol/L(用pH 8.0的Tris 10mmol/L、 EDTA 0.1mmol/L 缓冲液...

制作方法 CaCl2法 1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞 细胞壁通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗...

Ura/.5文库的转化与筛选制备酵母菌(已经转化pLexA?HERPUD1表达质粒)感受态,醋酸锂法转入文库质粒;?His?Trp,培养 4～6d。刮取菌液铺于SD/,6、2,另外,在沉积的脂褐质中还可以发现磷脂、中性脂质。CLN3编码的Battenin蛋白被认为是跨膜蛋白〔6,从人胎脑cDNA文库筛选与Herp有相互作用的蛋白质,以研究Herp的功能,...

3、毕氏酵母电转化法 (1)E.coli TOP10F’感受态细胞的制备 取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。 37℃，200 rpm，培养16～18小时。 灭菌500 ml离心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌体沉淀...