荧光定量PCR技术的荧光定量PCR的方法

发布网友发布时间：2022-04-22 05:17

共1个回答

热心网友时间：2024-03-26 13:42

接下来我们就来了解一下荧光定量的主要方法，我们如何选择合适的方法？荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。而荧光定量 PCR 的方法相应的可分为特异类和非特异类两类，特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

非特异性SYBR Green I染料法
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（结合示意图），在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强（作用机理图）。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
特异性Taqman水解探针法
Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；
PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量（如下图）。常用的荧光基团是FAM, TET, VIC, HEX。