技术|小动物活体成像技术原理及常见问题分析

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活体成像技术是生物医学研究中的重要工具，它允许科学家在不损害动物的情况下，观察活体状态下生物过程的组织、细胞和分子水平。这项技术广泛应用于研究肿瘤的生长、转移、疾病发展、基因表达变化等生物学过程，其非侵入性和直观性是其主要优势。

活体成像技术主要分为生物发光和荧光两大类。生物发光技术利用荧光素酶基因标记细胞或DNA，而荧光技术则使用荧光蛋白（如GFP、RFP、Mcherry等）标记细胞或蛋白等研究对象。生物发光因其操作简单和反应灵敏，广泛应用于肿瘤、分子互作、信号传导等领域。

荧光素酶（Luciferase）是能够产生生物荧光的酶，其中萤火虫荧光素酶最具代表性。其发光反应需要O2和Mg2+参与，CoA的存在能提高效率并延长发光时间。将萤火虫荧光素酶基因插入慢病毒载体中，通过CAG启动子过表达，作为报告基因在细胞中表达。

绿色荧光蛋白（GFP）在1962年被发现于水母中。其基因产生的蛋白质，在蓝色光激发下发出绿色荧光，需要冷光蛋白质Aequorin的辅助，以及与Ca2+的交互作用。GFP的基因插入慢病毒载体中，通过flap-Ub启动子过表达作为报告基因。

红色荧光蛋白，如mCherry，是来自蘑菇珊瑚的荧光蛋白，用于标记和示踪分子和细胞组分。mCherry的优点在于颜色与GFP兼容，且具有出色的光稳定性。

活体成像技术基于标记原理，通过将荧光素酶基因整合到细胞染色体DNA中表达荧光素酶，当给予荧光素作为底物时，即可在活细胞内产生发光现象。对于细菌，lux操纵子的基因表达使细菌持续发光，无需外源底物。

体内可见光成像系统由CCD镜头、成像暗箱和软件系统组成。标记细胞后，注射荧光素酶底物荧光素，利用制冷CCD相机和成像软件进行观测。

荧光成像基于激发光激发荧光基团到达高能态后发射光。绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白DsRed等荧光报告基团常用于标记。荧光成像成本低廉、操作简便，适用于植物分子生物学研究和小分子体内代谢观察。生物发光方法在活体动物体内成像中仍然占据主导地位。

影响因素包括底物给药方式、荧光标记物波长和动物毛发。腹腔注射和尾静脉注射是常用的底物给药方式，选择最佳延迟以标准化成像数据。荧光标记物波长的优化有助于提高信噪比和穿透深度。去除动物毛发以减少信号衰减，确保实验数据的准确性。