[经验分享]Western blot之内参介绍及选择
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发布时间：2024-10-15 04:50
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时间：2024-11-02 23:25
内参在western blot分析中扮演着关键角色，用来校准目的蛋白的表达水平。选择合适的内参蛋白至关重要，因为它们在不同细胞成分和条件下表达稳定。以下是关于内参的介绍和选择建议。
内参介绍
全细胞或细胞浆内参：如β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、tubulin（55KD）等，如肌动蛋白（包括β-actin和α-actin），在细胞中稳定存在，但需注意β-actin在某些条件下的不稳定性。
细胞核内参：如Lamin B1（66KD）、HDAC、PCNA等，如PCNA在增殖细胞中表达。
线粒体内参：如HSP60、COX IV，如COX IV（17KD）在细胞内膜中高度表达。
内参选择原则
1. 考虑蛋白的表达位置：选择相应部位的内参，如胞浆内参适用于β-actin，核内参选择PCNA等。
2. 实验环境因素：避免在特定条件下内参表达异常，如缺氧时GAPDH可能不宜，抗癌药物影响时Tubulin不可选。
3. 组织特异性：如actin的不同亚型在不同组织中分布不同，需根据具体实验选择对应的内参。
跑出完美内参条带的技巧
保证蛋白收集和定量的精确性。
上样时确保浓度一致，无蛋白丢失。
转膜过程需细心操作，减少气泡，保证转膜液渗透。
更换抗体和延长孵育时间，以保证抗体与条带的有效结合。
考虑药物影响和实验条件，避免使用影响内参的蛋白。
充分混匀样品，特别是含有珠子的。
添加Loading buffer时要快速，防止蛋白降解。
