【实验外包】免疫荧光实验方法及问题解答
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发布时间：2024-10-16 00:20
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时间：2024-11-07 04:18
免疫荧光方法的关键步骤包括：
1. 冰冻切片制备：确保使用新鲜组织，防止细胞结构破坏和抗原弥散。选择锋利的刀片和适度冷冻的组织，避免裂片和脱落。
2. 组织切片固定：使用冰丙酮等固定液，固定时间根据保存需求调整，确保白片及时固定并妥善保存。
3. 血清封闭：使用与二抗来源一致的血清，减少非特异性蛋白抗原的结合，通常封闭时间为10-30分钟。
4. 一抗孵育：包括孵育时间、抗体浓度，最佳条件为4度环境，通常37度孵育时间为1-2小时或过夜，具体条件需根据实验条件摸索。
5. 二抗孵育：一般在室温或37度下进行，时间通常为30分钟至1小时，二抗浓度需根据实验情况调整。
6. 复染：使用如DAPI等染料形成细胞轮廓，便于定位目标蛋白。
7. 封片：使用缓冲甘油等封片液，保持避光和湿度，避免产生气泡，确保封片过程正确无误。
8. 切片清洗：充分清洗切片以去除一抗、二抗等残留物质，减少非特异性染色，清洗时间为每次3min*3次，一抗孵育后的清洗为5次*5min。
9. 拍照：尽快拍照，不能及时拍照的样本应封好片并使用指甲油封固，以保持避光和湿度。使用荧光显微镜时，应遵循操作手册，确保在暗室中进行检查，避免紫外线对眼睛的伤害。
背景染色加深的可能原因包括抗体浓度过高、孵育时间过长或温度过高、DAB变质、显色时间过长、组织干燥、一抗变质等，解决方案涉及控制抗体浓度、严格操作规程、使用新鲜抗体等。
免疫荧光无法染色的原因可能与固定时间、triton透化、BSA孵育、抗体量不足、二抗浓度不足、标记物强度不足等有关，应调整实验条件，如增加固定时间、优化triton透化、适当调整抗体浓度等。
定位不准确的问题可能源于细胞核干扰、细胞状态差异、共定位问题或核定位问题，解决方法包括调整抗体浓度、改变细胞状态、采用共标记技术、优化抗体孵育条件等。
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时间：2024-11-07 04:18
免疫荧光方法的关键步骤包括：
1. 冰冻切片制备：确保使用新鲜组织，防止细胞结构破坏和抗原弥散。选择锋利的刀片和适度冷冻的组织，避免裂片和脱落。
2. 组织切片固定：使用冰丙酮等固定液，固定时间根据保存需求调整，确保白片及时固定并妥善保存。
3. 血清封闭：使用与二抗来源一致的血清，减少非特异性蛋白抗原的结合，通常封闭时间为10-30分钟。
4. 一抗孵育：包括孵育时间、抗体浓度，最佳条件为4度环境，通常37度孵育时间为1-2小时或过夜，具体条件需根据实验条件摸索。
5. 二抗孵育：一般在室温或37度下进行，时间通常为30分钟至1小时，二抗浓度需根据实验情况调整。
6. 复染：使用如DAPI等染料形成细胞轮廓，便于定位目标蛋白。
7. 封片：使用缓冲甘油等封片液，保持避光和湿度，避免产生气泡，确保封片过程正确无误。
8. 切片清洗：充分清洗切片以去除一抗、二抗等残留物质，减少非特异性染色，清洗时间为每次3min*3次，一抗孵育后的清洗为5次*5min。
9. 拍照：尽快拍照，不能及时拍照的样本应封好片并使用指甲油封固，以保持避光和湿度。使用荧光显微镜时，应遵循操作手册，确保在暗室中进行检查，避免紫外线对眼睛的伤害。
背景染色加深的可能原因包括抗体浓度过高、孵育时间过长或温度过高、DAB变质、显色时间过长、组织干燥、一抗变质等，解决方案涉及控制抗体浓度、严格操作规程、使用新鲜抗体等。
免疫荧光无法染色的原因可能与固定时间、triton透化、BSA孵育、抗体量不足、二抗浓度不足、标记物强度不足等有关，应调整实验条件，如增加固定时间、优化triton透化、适当调整抗体浓度等。
定位不准确的问题可能源于细胞核干扰、细胞状态差异、共定位问题或核定位问题，解决方法包括调整抗体浓度、改变细胞状态、采用共标记技术、优化抗体孵育条件等。
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时间：2024-11-07 04:18
免疫荧光方法的关键步骤包括：
1. 冰冻切片制备：确保使用新鲜组织，防止细胞结构破坏和抗原弥散。选择锋利的刀片和适度冷冻的组织，避免裂片和脱落。
2. 组织切片固定：使用冰丙酮等固定液，固定时间根据保存需求调整，确保白片及时固定并妥善保存。
3. 血清封闭：使用与二抗来源一致的血清，减少非特异性蛋白抗原的结合，通常封闭时间为10-30分钟。
4. 一抗孵育：包括孵育时间、抗体浓度，最佳条件为4度环境，通常37度孵育时间为1-2小时或过夜，具体条件需根据实验条件摸索。
5. 二抗孵育：一般在室温或37度下进行，时间通常为30分钟至1小时，二抗浓度需根据实验情况调整。
6. 复染：使用如DAPI等染料形成细胞轮廓，便于定位目标蛋白。
7. 封片：使用缓冲甘油等封片液，保持避光和湿度，避免产生气泡，确保封片过程正确无误。
8. 切片清洗：充分清洗切片以去除一抗、二抗等残留物质，减少非特异性染色，清洗时间为每次3min*3次，一抗孵育后的清洗为5次*5min。
9. 拍照：尽快拍照，不能及时拍照的样本应封好片并使用指甲油封固，以保持避光和湿度。使用荧光显微镜时，应遵循操作手册，确保在暗室中进行检查，避免紫外线对眼睛的伤害。
背景染色加深的可能原因包括抗体浓度过高、孵育时间过长或温度过高、DAB变质、显色时间过长、组织干燥、一抗变质等，解决方案涉及控制抗体浓度、严格操作规程、使用新鲜抗体等。
免疫荧光无法染色的原因可能与固定时间、triton透化、BSA孵育、抗体量不足、二抗浓度不足、标记物强度不足等有关，应调整实验条件，如增加固定时间、优化triton透化、适当调整抗体浓度等。
定位不准确的问题可能源于细胞核干扰、细胞状态差异、共定位问题或核定位问题，解决方法包括调整抗体浓度、改变细胞状态、采用共标记技术、优化抗体孵育条件等。
