nanoDSF 微量差示扫描荧光法表征蛋白配体互作

发布网友发布时间：2024-10-18 03:43

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热心网友时间：2024-12-05 10:09

差示扫描荧光法（DSF）是表征蛋白热稳定性的常用方法，广泛应用于多种研究领域。

通过荧光染料或蛋白内源荧光信号监测升温过程中蛋白构象的变化，计算其熔解温度Tm。染料法DSF常用的SYPRO Orange染料，蛋白去折叠疏水区暴露时，荧光强度增加。无标记DSF则基于蛋白去折叠过程中色氨酸发射光谱的位移进行检测。

当配体的结合增强蛋白稳定性时，其熔解温度Tm会升高。例如，未加入ATP时，Hsp90蛋白的Tm为63.46℃；在加入ATP后，结合增强了Hsp90蛋白的稳定性，Tm升高至67.53℃。这表明DSF方法可用于快速验证蛋白结合活性或高通量配体定性初筛。

然而，染料法DSF存在局限性。外源加入的染料可能影响蛋白的稳定性或干扰蛋白与配体的结合，并且在蛋白形成聚集时，染料会发生解离，不适用于多结构域蛋白的检测。相比之下，无标记DSF更为准确。

在研究腺苷A2A受体时，使用PR NT.48进行无标记DSF检测，得到的数据点更加密集、清晰，有助于确定A2A受体的最优纯化条件。此外，PR NT.48帮助完成了传统CPM-DSF未能完成的另一种GPCRs的验证。

图示展示了利用nanoDSF技术检测A2A-BRIL（A类GPCRs的代表）的热变性曲线。上半部分为蛋白变性过程中内源荧光变化，下半部分为上图对应的一阶导数，拐点处垂直线对应的温度即为Tm值。