流式细胞术——聚焦细胞凋亡及周期检测的最有效手段
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发布时间：2024-10-01 07:13
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时间：2024-10-23 06:54
1972年Keer首次提出了细胞凋亡（Apoptosis）的概念。然而，由于当时检测技术的*，这一细胞现象只能通过形态学描述，因此并未引起病理工作者的重视。直到80年代末，随着细胞生物学和分子生物学等科学理论的发展，凋亡的检测技术取得了显著进步，生物学家开始认识到细胞凋亡的重要生物学意义，从而形成了新的医学研究热点，推动了凋亡理论在生物医学各领域的广泛应用。
二、凋亡的意义
细胞凋亡是细胞按照自身程序结束生命的一种主动死亡过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡。这种淘汰机制是保证生命进化的基础。凋亡也是最常见的细胞程序性死亡方式，其发生过程受到严格的信号*。而凋亡触发通常来源于DNA损伤。
1. DNA损伤的原因
环境因素、化学因素、生物因素，如UV、离子辐射、基因毒性化学试剂等都会引起ssDNA/dsDNA损伤，导致DNA两条链交联或链内交联。正常细胞线粒体的一些代谢物（ROS）活性氧类过多也会引起损伤。
2. DNA损伤结局
急性效应：干扰核酸代谢，触发细胞周期阻滞或死亡
长期效应：不可逆转突变导致肿瘤
细胞周期阻滞，衰老，肿瘤/癌症，有丝*危象
三、细胞凋亡的特征
细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为*机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。
形态学特征：
细胞膜向外突起，细胞体积缩小
↓
染色质凝缩，然后断裂成碎片
↓
形成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体
↓
凋亡小体被邻近细胞吞噬
细胞坏死（necrosis）
概念：细胞受到激烈的物理、化学刺激或严重的病理*后，引起的细胞损伤和死亡。
特征：胞膜通透性增高，使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，细胞核破碎，最后细胞溶解破裂，溶酶体泄漏，引起炎症反应。
细胞凋亡与坏死的区别
从细胞凋亡角度看，肿瘤的发生是由于凋亡受阻所致
一般认为恶性转化的肿瘤细胞是因为失控生长，过度增殖，从细胞凋亡的角度看则认为是肿瘤的凋亡机制受到抑制不能正常进行细胞死亡清除的结果。肿瘤细胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活，并呈过表达状态。这些基因的激活和肿瘤的发生发展之间有着极为密切的关系。癌基因中一大类属于生长因子家族，也有一大类属于生长因子受体家族，这些基因的激活与表达，直接刺激了肿瘤细胞的生长，这些癌基因及其表达产物也是细胞凋亡的重要调节因子。许多种类的癌基因表达以后，阻断了肿瘤细胞的凋亡过程，使肿瘤细胞数目增加。因此，通过细胞凋亡角度和机制来设计对肿瘤的治疗方法就是重建肿瘤细胞的凋亡信号传递系统，抑制肿瘤细胞的生存基因的表达，激活死亡基因的表达。从细胞凋亡角度看，肿瘤的发生是由于凋亡受阻所致
四、基于流式细胞术的凋亡检测手段
PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测
PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料PI或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。
AnnexinV / PI的双染色法：
左下象限显示正常活细胞，为FITC- / PI-；右上象限为晚期凋亡或坏死细胞，为FITC+ / PI+；右下象限为早期凋亡细胞，呈现FITC+ / PI-
优点：
①对早期凋亡细胞检测灵敏
②细胞不需固定，省时省力。
③结果更可靠。
线粒体膜电位变化的检测：
在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1是一种理想的用于检测线粒体膜电位的荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。其原理是，当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，488nm激发时的最大发射波长为590nm，可以产生红色荧光，在流式上表现为FL1和FL2双阳性；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，488nm激发时最大发射波长为527nm，可以产⽣绿色荧光，形成流式图汇总所有细胞FL1为阳性。凋亡细胞则大多为FL1单阳性。不同荧光颜色的转变反应线粒体膜电位的变化，常用红绿荧光的相对比例衡量线粒体去极化的比例。
以上为两种常用且高效的细胞凋亡检测手段，通过流式细胞术来检测细胞凋亡，相比于其他手段，灵敏度最高，能够更为直观的看到细胞凋亡比率，并对不同凋亡时期具有更好的区分，是目前检测凋亡的首选实验方式。
