流式细胞术检测细胞周期和凋亡

发布网友发布时间：2024-10-01 07:13

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热心网友时间：2024-10-16 09:52

细胞周期检测：细胞周期是指从上一次细胞*结束到下一次*结束的过程，主要由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。在G0/G1期，细胞*成两个细胞，或进入静止期（G0期）。G0期与G1期在DNA含量上无法区分，细胞开始合成RNA和蛋白质，但DNA含量仍保持二倍体。S期，DNA开始合成，细胞核内DNA含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期，当DNA复制成为4倍体时，细胞进入G2期，继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。PI法是经典的周期检测方法，PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合量与DNA含量成正比，用流式细胞仪分析，可以得到细胞周期各阶段的DNA分布状态，从而计算出各期的百分含量。

实验流程：贴壁细胞和悬浮细胞的检测流程基本相同。首先，对细胞进行培养刺激，然后去除培养基，加入胰酶消化细胞。消化结束后，加入含血清的培养基终止胰酶消化，并将细胞重悬转移至离心管中。接着进行离心，去除上清，加入75%酒精重悬固定细胞，放入4℃冰箱中固定过夜。再次离心，去除上清，加入PBS洗3次，加入PI染色液，37℃染色30min。最后，将细胞上流式细胞仪检测。

细胞凋亡检测：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生，破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DN*段化之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。

实验流程：贴壁细胞和悬浮细胞的检测流程基本相同。首先，对细胞进行培养刺激，然后去除培养基，加入胰酶消化细胞。消化结束后，加入含血清的培养基终止胰酶消化，并将细胞重悬转移至含培养上清的离心管中。接着进行离心，去除上清，加入binding buffer重悬细胞，重复该步骤一次。然后，将细胞加入AnnexinV和PI染色液，轻轻混匀后室温避光孵育15min。再次离心，去除上清，加入PBS重悬细胞，立刻上流式细胞仪检测。