RACE PCRRACE产物的验证
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发布时间：2024-10-01 13:11
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时间：2024-11-13 09:23
为了确认RACE产物的有效性，验证步骤至关重要，特别是当产物多条或涉及多个基因家族时。以下是三种验证RACE产物的方法：
比较GSP和NGSP扩增得到的产物，如5'末端使用AP1和GSP1/NGSP1，3'末端用AP1和GSP2/NGSP2。
Southern blot可以提供额外的验证，用于检测特定的基因片段。
克隆并测序是另一种验证手段，通过回收RACE产物（小于2.5kb使用胶回收试剂盒，大片段则电泳回收）并将其插入载体，以获取序列信息。
对于5'末端产物，建议选择8-10个不同克隆来确保序列的完整性，因为反转录可能不会到达mRNA模板的5'端，并且T4DNA聚合酶可能剪切5'端的碱基。
获取全长cDNA有多种途径：
PCR方法：设计5'和3'GSP引物，根据RACE产物序列进行扩增。注意控制延伸时间和引物设计，避免拖带和高背景。通过电泳和琼脂糖凝胶纯化得到全长。
克隆方法：利用5'和3'RACE产物重叠区的酶切位点连接产物，然后克隆到载体中。
在操作过程中，务必关注接头和引物设计，以确保特异性扩增和减少非特异性产物。
扩展资料
RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
