好物好推荐:内参抗体!
发布网友
发布时间：2024-09-26 18:20
共1个回答
热心网友
时间：2024-10-04 20:07
内参，即内部参照（Internal Control），通常指哺乳动物细胞表达中的管家基因编码蛋白（Housekeeping Proteins），它们在各个组织和细胞中的表达相对稳定，常作为检测蛋白表达水平变化的参照物。
在进行Western Blot实验时，除了常规的蛋白抽提、定量、电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤，还需进行内参检测，以校正蛋白质定量和上样过程中的实验误差，确保实验结果的准确性。同时，内参也起到空白对照的作用，用于检测蛋白转膜是否完全、显色或发光体系是否正常。
常用的细胞总蛋白质内参包括GAPDH、细胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。对于植物样本，需使用特定的植物Actin蛋白作为内参。若实验样品仅含核蛋白而非细胞总蛋白提取液，则可使用组蛋白H（Histone H）或增殖细胞核抗原（PCNA）作为核内参抗体。对于针对线粒体微环境的研究，需提取线粒体总蛋白并检测其中的目标蛋白含量，常用COX IV或VDAC1作为内参抗体。
选择内参时，需综合考虑待检蛋白的分子量大小和在细胞中的位置，内参与检测的目的蛋白的分子量应相差5kDa以上。
常见的内参抗体包括：
1）GAPDH内参抗体
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，可广泛用作Western Blot蛋白质标准化的内参。
※不适合用于检测30kDa-40kDa大小目标蛋白的WB实验中。在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，也不适合做内参。
2）β-Actin内参抗体
Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到公认的，针对大多数组织和细胞来说，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但在一些少量特殊情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。
※适合用于检测38kDa-48kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织里，β-Actin的表达量非常低，不适合作为内参。
3）β-Tubulin抗体
Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa，实际检测条带均在55kDa左右。作为内参，β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。
※不适合用于检测50kDa-60kDa大小目标蛋白的WB实验中。在脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量很少，不适合做内参。
Tips: 内参的选择还需考虑实际的实验环境：
★在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。
★做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin 和β-Tubulin。
★设计实验方案的时候应该考虑实际的实验因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。
★做 Western Blot实验时，内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况，尤其是用 X 胶片曝光的。如果内参条带过度曝光，条带会显得很宽，妨碍对条带正确强度的判读，进而影响对其他实验结果的判断。最好的内参结果是：窄窄的，黑色实心条带。
华美内参抗体特别推荐
GAPDH Monoclonal Antibody
货号：CSB-MA000071M0m
种属反应性：Human
免疫原：Recombinant Human GAPDH protein
应用范围：ELISA, WB, IHC, IP, IF, FC
引用文献：A fluorescence method for determination of glucose transport by intestinal BBMV of common carp , Yang LP,et al.Anal Biochem,Aug 26
