膀胱肿瘤多药耐药基因的表达及其临床意义
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发布时间：2024-09-26 23:28
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时间：2024-11-08 11:22
膀胱肿瘤具有易复发的生物学特征，术后用药物膀胱腔内灌注治疗能明显改善预后。但化疗仍存在许多问题，其中多药耐药(MDR)是化疗失败的重要因素之一，因此MDR成为近年来肿瘤临床和基础研究中的热点。多种因素可引起MDR，其中人们研究最多、最广的是P-糖蛋白机制，蛋白的表达受多种因素的影响，本实验在基因的水平上观察多药耐药基因(MDR-1mRNA)的表达及对临床生物学行为的影响。
1、资料与方法
1.1 研究对象
全部标本均取自本科1998年1月至1998年12月间住院患者手术切除的膀胱肿瘤组织，术前经膀胱镜检查发现，并经病理学检查证实。病理类型：本组30例均为膀胱移行细胞癌，按WHO病理组织分级：G110例，G213例，G37例。初发的肿瘤16例，经化疗药物膀胱内灌注后复发的肿瘤14例。
正常对照为术中在膀胱肿瘤基底部2 cm以外的正常膀胱粘膜，均为术中切除并经组织学检查为正常者。
1.2 组织标本的采集及贮存
全部标本均在手术时切取膀胱肿瘤时收取，取材时避免取到肿瘤中心的坏死组织，实验选用手术后2 h内的鲜活标本或标本取材后立即放入-70 ℃超低温冰箱中保存待检。
1.3 主要试剂
AMV逆转录酶购自Promega公司，TaqDNA聚合酶购自中国科学院遗传所。
1.4 主要仪器
Gene Cycler PCR仪(B10-RAD，USA)。
1.5 多药耐药基因(MDR1)表达水平的检测
采用定量RT-PCR方法进行。
1.5.1 组织总RNA的提取：样品中总RNA提取采用异硫氰酸一步法进行，提取的总RNA加入50～100 μL DEPC去离子水溶解后，取部分样品经甲醛凝胶电泳检测鉴定其质量，并用紫外分光光度计测定A260及A280，计算A260/A280，比值均大于1.8，根据A260计算其RNA含量。
1.5.2 通过逆转录反应(reverse transcription)合成cDNA。逆转录反应在一个50 μL的反应体系中进行，反应体系中包含总RNA 5 μL，随机引物(Random Primer)0.5 μg RNA酶抑制剂(Rnasin 40 U，AMV 10 U，dNTP 40 μL)。在42 ℃水浴1 h，完成RT，在95 ℃水浴中5 min，将酶灭活后立即置冰浴中，加DEPC 50 μL，制备出用于PCR的cDNA的模板。
1.5.3 PCR扩增反应：PCR扩增反应采用两对寡核苷酸引物，其一为MDR-1mRNAcDNA引物，引物序列：MDR-1mRNA正义：5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′;反义：5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTCA-3′。内对照引物β2微球蛋白参照文献设计，5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA3′-ATCTTCAAACCTCCATGATG。
1.5.4 PCR结果判断：PCR产物经电泳分离后，阳性样品应有三条带，分子量大小分别为300 bp和170 bp，其中300 bp为内标b2-MG，而170 bp产物则为MDR-1mRNA基因。两条带强度之比(MDR-1mRNA/b2MG)为MDR-1mRNA基因表达相对值，据此相对值，即可以判断各样品中MDR-1mRNA表达程度的差异。
2、结 果
应用上述RT-PCR条件，对30例膀胱肿瘤的标本和26例正常膀胱粘膜组织进行了检测。26例正常膀胱粘膜标本中MDR-1mRNA的表达为15.4。30例膀胱肿瘤中MDR-1mRNA的阳性率为17/30(56.7)，其中G1、G2、G3肿瘤阳性率分别为40、61.5、71.4。16例初发肿瘤标本阳性率为37.5，14例化疗后复发肿瘤标本阳性率为78.6。
结果提示正常膀胱粘膜组织有MDR-1mRNA的表达，MDR-1mRNA的表达与肿瘤的分化程度有关。化疗后复发肿瘤MDR-1mRNA表达有明显增强。
3、讨 论
膀胱肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是膀胱肿瘤术后化疗的主要障碍。临床上许多肿瘤在经历了最初有效的化疗之后，最终仍难免于复发，其主要原因是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。与MDR1基因相关的常用化疗药物包括烷化剂类(如BCNU，ME-CCNU等)，植物碱类(如长春新碱、长春花碱、VM26等)，抗生素类(如丝裂霉素、阿霉素、博来霉素等)，激素类(如地塞米松等)。
这些药物通常为分子量较大的亲脂性化合物，是膀胱肿瘤治疗中常用的药物。当肿瘤细胞对上述其中一种药物发生耐药时，即可同时对其他各类药物发生交叉耐受，因此，膀胱肿瘤中MDR1基因的表达对化疗药物的耐药性密切相关。
