RNA pull down 检测

发布网友发布时间：2024-09-25 23:02

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热心网友时间：2024-09-29 16:57

RNA pull down实验是一种关键的生物技术，用于探测RNA结合蛋白与其靶RNA之间的相互作用。其基本步骤包括：首先，通过生物素标记RNA，然后将标记后的RNA与细胞裂解液混合，形成RNA-蛋白复合物，通过磁珠分离并纯化。接下来，通过Western blot验证复合物中的蛋白特性，必要时通过质谱筛选候选蛋白。具体操作如下：

1. 生物素标记RNA：使用特定试剂盒标记RNA，调整RNA浓度，进行标记反应，反应后通过酚氯仿提取并沉淀。

2. 细胞蛋白裂解：培养细胞，裂解并提取蛋白，同时制备实验input。

3. RNA沉淀：沉淀RNA，洗涤并溶解，准备进行后续的RNA-beads结合。

4. 磁珠预处理和RNA结合：磁珠清洗后，将标记的RNA与磁珠结合，室温孵育后洗涤以去除未结合的RNA。

5. RNA与蛋白相互作用检测：将细胞裂解液与磁珠结合，孵育后洗涤并释放结合的蛋白，进行Western blot或质谱分析。

6. 质谱分析：对富集的蛋白质进行还原、烷基化处理，再通过酶消化、FASP分离和iTRAQ标记，最终进行LC-MS/MS分析，通过MaxQuant处理数据并进行生物信息学分析。

这个实验的关键在于通过RNA pull down技术，研究人员可以准确地识别和研究RNA与特定蛋白的相互作用，从而深入了解基因调控机制。