qPCR中奇奇怪怪的扩增曲线分析

发布网友发布时间：2024-09-26 22:05

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热心网友时间：2024-11-23 01:58

在qPCR（定量聚合酶链反应）中，扩增曲线并非一条标准的指数曲线，而是呈现出S形，这是由于DNA聚合酶活性衰减、反应物质消耗和副产物干扰等因素影响了扩增进程。这些因素导致PCR在初期按指数增长，但随着循环次数增加，最终会进入平台期，其出现时间及强度变化很大，难以精确控制。

尽管平台期变化大，但在指数增长阶段，扩增曲线的重复性却非常好。通过设定阈值（Threshold），如在指数增长区设定荧光检测界限，我们可以得到Ct值，即达到阈值时的循环数。Ct值与模板量的对数值之间存在反比关系，这是RealTime PCR定量分析的关键原理。

RealTime PCR区别于传统PCR在于实时监测并精确量化。通过梯度稀释标准品，Ct值与起始模板量的关系可以用作标准曲线，未知样本的Ct值可以由此计算出其模板含量。Ct值的计算方法有交点法和二次求导法，后者因不受阈值设定影响，具有高重现性和准确性。

实验中常见问题包括Ct值不一致、NTC扩增、以及扩增曲线异常。如Ct值过大，可能源于RNA降解或扩增效率问题，需通过优化反应条件或引物设计解决。扩增曲线问题可能涉及模板量、纯度、仪器校准或反应程序设置等，需针对性调整。

在进行qPCR时，充分沟通与准备至关重要，以确保实验的准确性和成功率。祝大家在实验中取得理想结果，顺利达成目标！