【星耀小课堂】纯化基操篇|大肠杆菌与内毒素的爱恨情仇——人类【纯化...
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发布时间：2024-09-05 12:31
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时间：2024-10-07 15:58
首先，我们需要了解内毒素的构成与特性。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜最外层的脂多糖（LPS）成分，主要由O-特异性侧链、核心多糖和类脂 A（lipid A）构成。类脂 A 具有多磷酸根结构，等电点约为3.1，在常规pH条件下带有部分负电荷，展现出疏水性和弱亲水性，使其能够结合带正电和疏水性的分子。
内毒素的结构决定了其在水溶液中形成不同大小的聚集体，分子量范围在10-20kD到1000kD以上。这种特性为内毒素的去除提供了多种方法。以下列举了一些常用的内毒素去除方法：
1. **吸附法**：石棉及活性炭等材料因其孔隙结构，能有效吸附内毒素。此法适用于纯水溶液中的内毒素去除。
2. **化学降解法**：通过强酸、强碱或氧化剂作用，使内毒素结构发生降解，从而达到去除内毒素的目的。此法常用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的内毒素去除。
3. **相分离法**：利用相似相溶的萃取原理，在低温下，Triton X-114和Triton X-100等表面活性剂溶解于水相，而内毒素则溶解在其中。随着温度升高，Triton的溶解度降低，与内毒素一起形成沉淀，通过离心去除。此法适用于热稳定性蛋白的内毒素去除，并需建立残留检测方法。
4. **超滤法**：基于分子量差异，超滤膜能够有效去除样品中的内毒素。常用300kDa超滤膜，适用于水溶液或小分子溶液中的内毒素去除。
接下来，我们将重点探讨层析技术和切向流过滤技术在内毒素去除中的应用策略。
层析法是内毒素去除的有效手段，包括离子交换层析、疏水层析、分子筛层析、亲和交换层析等。
1. **离子交换层析法**：利用内毒素的低等电点，通过选择合适的离子交换填料（如阴离子交换的Capto Q）在特定pH条件下去除内毒素。通过调节电导率、pH值等条件，确保目标蛋白流穿，内毒素被柱子吸附。实例中，使用HiTrap Q XL层析柱在特定条件下去除内毒素，同时保持目标蛋白的收率和纯度。
2. **疏水层析**：在高盐条件下，内毒素形成复合体，不与疏水填料结合，以流穿形式去除。此法适用于对盐浓度变化不敏感的蛋白，通过研究不同盐浓度，优化去除效果。实例显示，使用疏水层析有效降低了样品中的内毒素。
3. **凝胶过滤层析**：基于内毒素与目标蛋白分子量差异，通过凝胶过滤层析实现分离，将大分子内毒素与目标蛋白分离。实例中，利用Superdex 200柱子有效去除含有内毒素的抗体样品中的杂质，实现目标蛋白的纯化。
4. **复合模式层析**：复合模式层析采用带有电荷、疏水及氢键等化学基团的填料，通过多种相互作用去除内毒素。实例中，Capto Adhere层析柱结合优化条件，有效去除质粒pDNA样品中的内毒素杂质。
切向流过滤技术通过膜孔径大小筛选去除内毒素，适用于不同水溶液中的内毒素去除。实例显示，使用100kDa膜进行切向流过滤，结合稀释样品和添加洗涤剂，能显著提高内毒素的去除效率。
总结，内毒素的去除需综合考虑生物制品特性和工艺条件，采用多种方法的组合策略。层析技术与切向流过滤技术是内毒素去除的重要手段，同时结合非离子去污剂和添加剂，有助于提高终产品内毒素含量的安全性。耀海生物作为生物医药CDMO服务提供商，通过不断探索和优化工艺条件，为客户提供高效、安全的内毒素去除方案，确保生物制品的质量和安全性。
