如何快速提取全血RNA的步骤
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发布时间：2022-05-06 21:23
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时间：2023-07-31 01:03
第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙 醇!
使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X.
操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%,如1 ml RLT 中加入10μl β-巯基乙醇.此裂解液最好现用现配.配好的RLT 4℃可放置一个月.
1. 在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5 ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 （颠倒混匀后）和3体积的红细胞裂解液RLB,颠倒混匀,可轻弹管壁,确保混匀.
2. 室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）.
如果RNA降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充*解.
3. 12,000 rpm离心20秒,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团）,留下完整的管底白细胞团.
离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2,3.
β-巯基乙醇上清尽可能的吸弃,残留过多会稀释裂解液,造成裂解结合异常,产量纯度降低.
4. 涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬,加入350μl（<0.5 ml全血）或者600μl（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT,吹打混匀后用手剧烈振荡20秒,充*解.病人血样中白细胞数量可能大幅增加,应该适当减少处理量.或者按照350μl（<2x106白细胞）或者600μl（2x106-1x107白细胞）比例加RTL.
5. 用带钝针头的一次性 1 ml（配0.9mm针头） 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量.
6. 较精确估计裂解物体积,加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心.
7. 立刻将混合物（每次小于700μl,多可以分两次加入）加入一个吸附柱RA中,（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒,弃掉废液.
8. 加700μl 去蛋白液RW1,室温放置30秒,12,000rpm 离心30秒,弃掉废液.
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心.
9. β-巯基乙醇加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!）,12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液.加入500μl漂洗液RW,重复一遍.
10. 将吸附柱RA放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应.
11. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-80℃水浴中加热效果更好）, 室温放置1分钟,12,000 rpm 离心1分钟.
12. 如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白细胞,加30-50μl RNase free water重复步骤11,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍（如果需要RNA浓度高）.
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择.
