您好，我看到08年回答别人关于nuclear run-on的帖子，请问您还有没有更多的关于nuclear run-on的资料？
发布网友
发布时间：2022-05-06 21:23
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热心网友
时间：2023-09-19 17:12
原理：
将RNA固定于尼龙膜上
以DNA探针识别待检mRNA
这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到*纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与*纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与*纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml
EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。
Nuclei Run-on
原理：
迅速冷冻，使细胞核内正在转录的mRNA复合体处于冻结状态
加入ATP/GTP/CTP/32P-UTP，重新恢复mRNA的转录并使之结束（标记冻结时正在转录的mRNA)，提取mRNA
以cDNA探针及对照cDNA标记尼龙膜后检测目标mRNA
2、操作过程：
细胞核的提取
处理细胞（培养于10厘米培养皿）
吸去培养液，迅速将细胞放于冰上
用10ml冰预冷的PBS洗细胞一次
加10ml冰预冷的PBS，刮下细胞，移入离心管
500g离心5分钟后弃去液体
边混悬边加入4ml NP－40裂解液
10mM Tris-HCL, PH7.4
10mM NaCL
3mM MgCL2
0.5% NP-40
置冰上孵育5分钟，同前离心，弃去上清
以4ml NP－40裂解液重悬沉淀、洗涤，同前离心并弃去上清
以200ul甘油储存液重悬沉淀，保存于液氮中甘油
50mM Tris-HCL, PH8.3
40%甘油
5mM MgCL2
0.1mM EDTA
Run-on
将冻存的细胞核解冻
加入200ul 2X反应缓冲液
10mM Tris-HCL, PH8
5mM MgCL2
0.3M KCL
5mM DTT
1mM ATP
1mM CTP
1mM GTP
加入32P-UTP100uCi
于30℃反应30分钟，同时震荡
总RNA提取：
加入1.4ml RLT（QIAGEN公司）
用Rneasy Mini Kit抽取总RNA
用700ul SW1洗一次
用500ul RPE洗4次
用110ul RNase free ddH2O洗脱两次
取3ul加入液闪检测液测取CPM值
探针cDNA标记尼龙膜：
0.5N NaOH处理尼龙膜
5－10ug/样点膜
自然晾干
Crosslink
4) 杂交：
取相等CPM量RNA，加入2ml TES/0.6M NaCL
10mM TES
10mM EDTA
0.2%SDS
在杂交炉中，68℃反应过夜
用2XSSC/0.1%SDS洗膜三次
用0.1XSSC/0.1%SDS洗膜三次
曝光于X光胶片
