定量PCR实验中的Ct值与Cq 值是什么?

发布网友发布时间：2024-09-10 05:37

共1个回答

热心网友时间：2024-09-10 06:40

定量PCR实验中的Cq值，即量化周期，是关键指标，用于量化目标序列的绝对量或比较样本之间目标序列的相对量。实验通过实时监测目标的扩增过程中发出的荧光信号，从而获得这一数据。在实时荧光定量PCR中，荧光染料和探针应是序列特异性的，但在实验中往往出现大量的背景荧光。为了分析背景中的荧光信号并了解PCR循环情况，设定阈值线成为关键。

阈值线是检测水平或反应达到高于背景水平的荧光强度的点。在实验前，您（或您的PCR仪中的软件）设定阈值水平。这是一条图表中的线，代表高于背景荧光的水平，通常在指数阶段开始时与反应曲线相交。Cq值是您的样品反应曲线与阈值线相交处的PCR循环数，表明从您的样本中检测到真实信号所需的时间。实时PCR运行中，每个样品的反应曲线都有其对应的Cq值，PCR仪软件会计算并绘制图表。

Cq值与样本中目标核酸的数量成反比，与样本中的目标拷贝数相关。较低的Cq值（通常低于29个循环）表示大量的目标序列。较高的Cq值（超过38个循环）意味着较低的目标核酸量。高Cq值可能表示目标或PCR设置存在问题，如PCR效率低、模板不足或样品处理不当等。

影响Cq值的因素包括生物事件、PCR反应准备和PCR组分等。生物事件如目标基因响应治疗而上调/下调会导致样本之间的Cq值差异。同时，溶液中的pH值和盐浓度、荧光比率、反应效率、模板量等也会影响Cq值。确保使用高质量的PCR组件，检查溶液pH值和监测盐沉淀。反应值是FAM染料与ROX染料的荧光比率，FAM荧光不变时，较低量的ROX会产生较高的反应值。PCR效率取决于预混液性能、引物特异性、退火温度和样品质量，通常90%以上的效率是可以接受的。

标准曲线上的每个点至少运行三次重复，对于低拷贝数输入，重复数应更高，以减少重复间的变化。Cq值晚的常见原因包括模板量不足、核酸分离次优、逆转录酶活性较差、RNA/cDNA降解以及PCR抑制等。确保实验空间的清洁，改善RNA处理行为，避免cDNA的多次冻融循环，以减少RNA降解。优化PCR仪参数，确保PCR反应的稳定性和准确性。通过排除上述因素，可提高定量PCR实验的准确性和可靠性。