以棕榈酰化为例,谈谈蛋白修饰在肿瘤研究中的研究策略
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发布时间：2024-08-18 18:16
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时间：2024-08-28 01:24
蛋白的棕榈酰化是一类蛋白的翻译后修饰，通过将一个16C的棕榈酰基团以硫酯键与蛋白的半胱氨酸残基结合，提高了蛋白的疏水性，影响了蛋白的亚细胞定位、酶活和内膜系统中的转运等，参与一系列的生物学过程。棕榈酰化的过程是可逆的，可以在蛋白上加上棕榈酰辅酶A，这个过程有ZDHHC催化。在哺乳动物中有23个ZDHHC成员，分别是ZDHHC1至ZDHHC24（除ZDHHC10外）；另一方面，棕榈酰化基团也可被清除，依赖于APT1, APT2, PPT1, PPT2, ABHD17A/B/C和ABHD10等催化酶（图1）[1]。
若从被修饰蛋白出发，进行棕榈酰化的研究，以下几个问题，是考虑的重点：
若从棕榈酰化酶出发，进行棕榈酰化研究，以下几个问题，是考虑的重点：
总体而言，棕榈酰化的研究，还是比较套路化，研究框架如图2所示：
01 明确底物被棕榈酰化和明确棕榈酰化对底物的影响
以2021年发表于nature communications的关于GLUT1的棕榈酰化，促进胶质母细胞瘤的糖酵解和肿瘤发生的研究为例[2]。
葡萄糖转运蛋白GLUT1是葡萄糖吸收的关键蛋白[3]，而糖代谢旺盛是肿瘤细胞的非常重要的分子特征[4]，GLUT1在很多类别的肿瘤细胞中均高表达，并且与不良的预后相关[5]。因此GLUT1是肿瘤研究中经久不衰的研究热点。关于GLUT1的棕榈酰化，早在1995年就有了相关报道[6]。那么，针对一个已知棕榈酰化的研究非常透彻的热点蛋白，作者是如何进行深入的研究，在2021年依然能够发表于nature communications的呢。
GLUT1的乙酰化促进其定位于质膜
作者首先用一个棕榈酰化抑制剂，2-BP处理神经母细胞瘤（GBM）细胞系，用GLUT1的抗体进行免疫荧光（IF）实验，明确棕榈酰化对GLUT1亚细胞定位的影响。结果显示，在两个细胞系中，2-BP处理均使得GLUT1从质膜（PM）定位改变为细胞质定位（图3a）。分别提取细胞的可溶性蛋白和膜蛋白进行WB分析，显示2-BP处理后去棕榈酰化的GLUT1定位与水溶性蛋白中，棕榈酰化的GLUT1定位于质膜上（图3b）。作者用棕榈酸类似物, 炔基棕榈酸（Alkynyl PA） 标记细胞，用棕榈酰化的GLUT1抗体进行WB，可检测到棕榈酰化的GLUT1。在此基础上用具有棕榈酰化剪切作用的羟胺（HAM）处理，棕榈酰化的GLUT1无法被检测到（图3c）。acyl-PEGyl交换凝胶移位实验（APE）的棕榈酰化和非棕榈酰化的蛋白在凝胶电泳的迁移速度不同，可以区分两者。作者利用APE实验进一步明确了GLUT1在GBM细胞系中的棕榈酰化修饰（图3d）。以上实验证明GLUT1的乙酰化修饰维持了GBM细胞中GLUT1的质膜定位的维持。
以上案例是棕榈酰化影响了底物的亚细胞定位，分别用了IF和提取不同组份的蛋白做wb进行验证。有报道称，棕榈酰化可以影响PD-L1的蛋白稳定性[7]和影响E3泛素化酶PHF2的泛素化活性[8]，那么针对这两种蛋白功能的影响，则需要通过不同的检测方法进行验证。
在这一项关于乳腺癌中PD-L1棕榈酰化稳定PD-L1的蛋白水平的研究中，除了用棕榈酰化的PD-L1的抗体验证棕榈酰化，用PD-L1的抗体检测PD-L1的蛋白水平，也是一个指示其棕榈酰化对其蛋白功能影响的证据（图4）。
在一项针对肝细胞癌的研究中，在明确了PHF2被棕榈酰化后，又基于PHF2是一个E3 ligase，作者鉴定到了PHF2的泛素化底物SREBP1c，用Co-Ip实验证明了这两个蛋白发生互作（图5a），两个蛋白在细胞中共定位（图5b）以及用体外泛素化实验证明了PHF2对SREBP1c的泛素化修饰（图5c）。
02 明确底物的棕榈酰化位点
棕榈酰化的研究一般都会涉及到棕榈酰化位点。一方面是因为棕榈酰化只发生在Cys残基，潜在的修饰位点不多，通过实验方法验证是一个可行的工作。另一方面，通过对棕榈酰化位点进行定点突变，可以更进一步阐述棕榈酰化的发生和对底物功能以及细胞功能的影响。
一种方法是定点突变所有Cys位点，例如GLUT1，作者采用了这个策略。将各个位点突变后进行棕榈酸化检测和蛋白定位分析，实验方法和前述的鉴定棕榈酰化方法是一致的，鉴定到Cys207是GLUT1的棕榈酰化位点（图6）。
第二种方法是检索棕榈酰化数据库（ csspalm.biocuckoo.org），鉴定到Cys272是PD-L1棕榈酰化位点（图7）。
第三种方法是LC-MS方法进行鉴定。发生了棕榈酰化的氨基酸残基，分子量不同，利用MS可以将其鉴定出，据此鉴定到C23是PHF2的棕榈酰化位点（图8）。
03 筛选和鉴定棕榈酰化酶
因哺乳动物共有23个棕榈酰化酶，针对每一个棕榈酰化酶进行敲除或敲低，可以鉴定到关注底物的棕榈酰化酶，此外，通过IP-MS等方法进行底物的互作蛋白筛选，也可以鉴定到与其互作的棕榈酰化酶。
为明确GLUT1的棕榈酰化酶，作者针对这23个基因设计了guide RNA,用Crispr/Cas9系统敲除各个棕榈酰化酶，分析GLUT1的棕榈酰化，鉴定到DHHC9敲除的细胞系中GLUT1的棕榈酰化受到抑制，说明DHHC9是调节GLUT1的关键酶，而后针对DHHC9进行体外棕榈酰化实验（图9a，b），将DHHC9敲除、定点突变进行棕榈酰化鉴定（图9c，d），APE实验（图9e）进一步确定DHHC9对GLUT1的棕榈酰化。随后敲除和定点突变DHHC9分析GLUT1的亚细胞定位（图9f，g），进一步明确DHHC9是GLUT1的棕榈酰化酶。
PD-L1的棕榈酰化酶ZDHHC9是通过IP-MS筛选到的，鉴定其对PD-L1的棕榈酰化，研究方法与DHHC9棕榈酰化GLUT1是一致的，此处不展开阐述。
04 棕榈酰化的生物学意义
当明确了某个关注蛋白确实被棕榈酰化后，下一个重要的问题是棕榈酰化对细胞的功能以及生物体产生了什么影响，这可以从细胞层面和动物层面进行阐述，研究方法取决于底物的蛋白功能。
例如，GLUT1是一个葡萄糖转运蛋白，那么想要研究细胞的功能，糖酵解的那一套研究方法，例如糖吸收实验、ECAR实验、乳酸产生等，可以帮助阐释基于GLUT1棕榈酰化的信号开和关，对细胞功能的影响。PD-L1是一个免疫检查点分子，那么关于T细胞的杀伤性实验，可以分析PD-L1的功能。进一步地，肿瘤细胞的功能，如克隆形成实验、MTT，CCK8等，都是可以进一步描述糖酵解对细胞功能的影响。PHF2是一个E3 ligase，那么泛素化相关研究手段，体外泛素化实验、MG132处理等，都可以证明棕榈酰化对底物功能的影响。
此外，动物层面，则可以通过观察荷瘤小鼠以及关键蛋白敲除的小鼠的肿瘤大小、动物生长状况、生存期等进一步阐述棕榈酰化在体内的调控作用。
总体而言，蛋白的翻译后修饰，看起来似乎非常高大上，当我们将研究思路剖析以后，会发现实验操作都是相对简单，需要考虑的维度也是比较少的。我们此处参考的是2018年发表的cell research，2021年和2023年发表的nature communications，可见棕榈酰化还是一个以相对简单的研究思路和研究手段，获得被高度认可的方向。当然，随着科研的快速发展，棕榈酰化的生物学意义，在未来的研究中，还需要做得更深入，从细胞系的实验到小鼠模型到临床样本的实验，也是一个未来的发展趋势。
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时间：2024-08-28 01:24
蛋白的棕榈酰化是一类蛋白的翻译后修饰，通过将一个16C的棕榈酰基团以硫酯键与蛋白的半胱氨酸残基结合，提高了蛋白的疏水性，影响了蛋白的亚细胞定位、酶活和内膜系统中的转运等，参与一系列的生物学过程。棕榈酰化的过程是可逆的，可以在蛋白上加上棕榈酰辅酶A，这个过程有ZDHHC催化。在哺乳动物中有23个ZDHHC成员，分别是ZDHHC1至ZDHHC24（除ZDHHC10外）；另一方面，棕榈酰化基团也可被清除，依赖于APT1, APT2, PPT1, PPT2, ABHD17A/B/C和ABHD10等催化酶（图1）[1]。
若从被修饰蛋白出发，进行棕榈酰化的研究，以下几个问题，是考虑的重点：
若从棕榈酰化酶出发，进行棕榈酰化研究，以下几个问题，是考虑的重点：
总体而言，棕榈酰化的研究，还是比较套路化，研究框架如图2所示：
01 明确底物被棕榈酰化和明确棕榈酰化对底物的影响
以2021年发表于nature communications的关于GLUT1的棕榈酰化，促进胶质母细胞瘤的糖酵解和肿瘤发生的研究为例[2]。
葡萄糖转运蛋白GLUT1是葡萄糖吸收的关键蛋白[3]，而糖代谢旺盛是肿瘤细胞的非常重要的分子特征[4]，GLUT1在很多类别的肿瘤细胞中均高表达，并且与不良的预后相关[5]。因此GLUT1是肿瘤研究中经久不衰的研究热点。关于GLUT1的棕榈酰化，早在1995年就有了相关报道[6]。那么，针对一个已知棕榈酰化的研究非常透彻的热点蛋白，作者是如何进行深入的研究，在2021年依然能够发表于nature communications的呢。
GLUT1的乙酰化促进其定位于质膜
作者首先用一个棕榈酰化抑制剂，2-BP处理神经母细胞瘤（GBM）细胞系，用GLUT1的抗体进行免疫荧光（IF）实验，明确棕榈酰化对GLUT1亚细胞定位的影响。结果显示，在两个细胞系中，2-BP处理均使得GLUT1从质膜（PM）定位改变为细胞质定位（图3a）。分别提取细胞的可溶性蛋白和膜蛋白进行WB分析，显示2-BP处理后去棕榈酰化的GLUT1定位与水溶性蛋白中，棕榈酰化的GLUT1定位于质膜上（图3b）。作者用棕榈酸类似物, 炔基棕榈酸（Alkynyl PA） 标记细胞，用棕榈酰化的GLUT1抗体进行WB，可检测到棕榈酰化的GLUT1。在此基础上用具有棕榈酰化剪切作用的羟胺（HAM）处理，棕榈酰化的GLUT1无法被检测到（图3c）。acyl-PEGyl交换凝胶移位实验（APE）的棕榈酰化和非棕榈酰化的蛋白在凝胶电泳的迁移速度不同，可以区分两者。作者利用APE实验进一步明确了GLUT1在GBM细胞系中的棕榈酰化修饰（图3d）。以上实验证明GLUT1的乙酰化修饰维持了GBM细胞中GLUT1的质膜定位的维持。
以上案例是棕榈酰化影响了底物的亚细胞定位，分别用了IF和提取不同组份的蛋白做wb进行验证。有报道称，棕榈酰化可以影响PD-L1的蛋白稳定性[7]和影响E3泛素化酶PHF2的泛素化活性[8]，那么针对这两种蛋白功能的影响，则需要通过不同的检测方法进行验证。
在这一项关于乳腺癌中PD-L1棕榈酰化稳定PD-L1的蛋白水平的研究中，除了用棕榈酰化的PD-L1的抗体验证棕榈酰化，用PD-L1的抗体检测PD-L1的蛋白水平，也是一个指示其棕榈酰化对其蛋白功能影响的证据（图4）。
在一项针对肝细胞癌的研究中，在明确了PHF2被棕榈酰化后，又基于PHF2是一个E3 ligase，作者鉴定到了PHF2的泛素化底物SREBP1c，用Co-Ip实验证明了这两个蛋白发生互作（图5a），两个蛋白在细胞中共定位（图5b）以及用体外泛素化实验证明了PHF2对SREBP1c的泛素化修饰（图5c）。
02 明确底物的棕榈酰化位点
棕榈酰化的研究一般都会涉及到棕榈酰化位点。一方面是因为棕榈酰化只发生在Cys残基，潜在的修饰位点不多，通过实验方法验证是一个可行的工作。另一方面，通过对棕榈酰化位点进行定点突变，可以更进一步阐述棕榈酰化的发生和对底物功能以及细胞功能的影响。
一种方法是定点突变所有Cys位点，例如GLUT1，作者采用了这个策略。将各个位点突变后进行棕榈酸化检测和蛋白定位分析，实验方法和前述的鉴定棕榈酰化方法是一致的，鉴定到Cys207是GLUT1的棕榈酰化位点（图6）。
第二种方法是检索棕榈酰化数据库（ csspalm.biocuckoo.org），鉴定到Cys272是PD-L1棕榈酰化位点（图7）。
第三种方法是LC-MS方法进行鉴定。发生了棕榈酰化的氨基酸残基，分子量不同，利用MS可以将其鉴定出，据此鉴定到C23是PHF2的棕榈酰化位点（图8）。
03 筛选和鉴定棕榈酰化酶
因哺乳动物共有23个棕榈酰化酶，针对每一个棕榈酰化酶进行敲除或敲低，可以鉴定到关注底物的棕榈酰化酶，此外，通过IP-MS等方法进行底物的互作蛋白筛选，也可以鉴定到与其互作的棕榈酰化酶。
为明确GLUT1的棕榈酰化酶，作者针对这23个基因设计了guide RNA,用Crispr/Cas9系统敲除各个棕榈酰化酶，分析GLUT1的棕榈酰化，鉴定到DHHC9敲除的细胞系中GLUT1的棕榈酰化受到抑制，说明DHHC9是调节GLUT1的关键酶，而后针对DHHC9进行体外棕榈酰化实验（图9a，b），将DHHC9敲除、定点突变进行棕榈酰化鉴定（图9c，d），APE实验（图9e）进一步确定DHHC9对GLUT1的棕榈酰化。随后敲除和定点突变DHHC9分析GLUT1的亚细胞定位（图9f，g），进一步明确DHHC9是GLUT1的棕榈酰化酶。
PD-L1的棕榈酰化酶ZDHHC9是通过IP-MS筛选到的，鉴定其对PD-L1的棕榈酰化，研究方法与DHHC9棕榈酰化GLUT1是一致的，此处不展开阐述。
04 棕榈酰化的生物学意义
当明确了某个关注蛋白确实被棕榈酰化后，下一个重要的问题是棕榈酰化对细胞的功能以及生物体产生了什么影响，这可以从细胞层面和动物层面进行阐述，研究方法取决于底物的蛋白功能。
例如，GLUT1是一个葡萄糖转运蛋白，那么想要研究细胞的功能，糖酵解的那一套研究方法，例如糖吸收实验、ECAR实验、乳酸产生等，可以帮助阐释基于GLUT1棕榈酰化的信号开和关，对细胞功能的影响。PD-L1是一个免疫检查点分子，那么关于T细胞的杀伤性实验，可以分析PD-L1的功能。进一步地，肿瘤细胞的功能，如克隆形成实验、MTT，CCK8等，都是可以进一步描述糖酵解对细胞功能的影响。PHF2是一个E3 ligase，那么泛素化相关研究手段，体外泛素化实验、MG132处理等，都可以证明棕榈酰化对底物功能的影响。
此外，动物层面，则可以通过观察荷瘤小鼠以及关键蛋白敲除的小鼠的肿瘤大小、动物生长状况、生存期等进一步阐述棕榈酰化在体内的调控作用。
总体而言，蛋白的翻译后修饰，看起来似乎非常高大上，当我们将研究思路剖析以后，会发现实验操作都是相对简单，需要考虑的维度也是比较少的。我们此处参考的是2018年发表的cell research，2021年和2023年发表的nature communications，可见棕榈酰化还是一个以相对简单的研究思路和研究手段，获得被高度认可的方向。当然，随着科研的快速发展，棕榈酰化的生物学意义，在未来的研究中，还需要做得更深入，从细胞系的实验到小鼠模型到临床样本的实验，也是一个未来的发展趋势。
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