southern印迹杂交方法步骤
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发布时间：2024-08-18 18:27
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时间：2024-08-22 14:59
Southern印迹杂交是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定基因在DNA样本中的存在。以下是详细的步骤:
1. 待测核酸样品制备
- 制备基因组DNA，通常通过细胞裂解和消化去除蛋白质和RNA，然后用酚/氯仿抽提。
- 用限制酶将DNA切割成不同大小的片段，可根据需要选择单限制酶或多酶消化，之后进行电泳分离和可能的乙醇沉淀。
2. 琼脂糖凝胶电泳
- 将DNA片段分离在0.8-1.0%琼脂糖凝胶中，利用电泳分辨不同大小的DNA片段，同时加入标准分子量DNA作为标记。
- 根据DNA片段大小，调整凝胶浓度，使用分子质量标志物进行电泳，并评价样品质量。
3. 电泳凝胶预处理
- 对大片段DNA，通过脱嘌呤处理使其断裂成小片段，便于转移。
- 对小片段DNA，直接进行电泳后处理，包括变性、中和和平衡步骤。
4. 转膜
- 将处理后的DNA片段转移到固相支持物（如NC膜或Nylon膜）上，保持DNA片段在凝胶中的位置不变。
5. 探针标记
- 探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸，通过放射性标记或地高辛标记进行标记，如T4多聚核苷酸激酶末端标记。
6. 预杂交
- 在封闭塑料袋中进行预杂交，用预杂交液封闭膜上非特异性位点，确保后续杂交的特异性。
7. Southern杂交
- 将标记探针加入预杂交过的膜上，进行杂交反应，通常在高离子强度缓冲液中进行，根据探针和靶序列同源性选择适当的杂交条件。
8. 洗膜
- 杂交后，通过一系列条件的洗涤去除未结合的探针，确保检测结果的准确性。
9. 放射性自显影检测
- 将滤膜放在暗盒中，进行X光底片曝光，然后冲洗和显影，最终得到放射性信号，反映目标DNA的存在。
扩展资料
Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
