Western杂交操作步骤

发布网友发布时间：2024-08-18 18:27

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热心网友时间：2024-08-21 23:21

Western杂交操作流程如下：

首先，使用预先制备的SDS-PAGE分离蛋白凝胶，确保凝胶的纯度。
接着，准备一张与凝胶尺寸相同的滤纸，在电泳缓冲液中预先湿润，将其置于Scotch-Brit Pad上，滤纸的一端紧贴凝胶的阴极，确保胶面充分浸湿并排出气泡。
在凝胶阳极面放置同样大小的浸湿硝酸纤维素膜，再在膜的阳极端放置滤纸，再次排除气泡，并在上方放置Scotch-Brit Pad以保持稳定性。
接下来，构建"三明治"结构，将此装置置于塑料支撑物中间，插入电转移装置，加入电转移缓冲液。
启动电源，以14V电压在4℃下进行转移，通常持续4小时或过夜，目标是使蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。
转移后，滤膜需在丽春红S溶液中染色5分钟，然后用蛋白染色水脱色2分钟，接着照相，并用印度墨水标记分子量标准，再进行水洗脱色。
滤膜放入塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液（1克速溶去脂奶粉溶解于100ml PBS），在室温下摇动1小时，以封闭特异性抗体结合位点，随后倒出多余缓冲液。
在封闭缓冲液中稀释第一抗体，将其加入滤膜，室温放置1小时后，用200mL PBS反复洗涤四次，确保抗体均匀附着。
重复步骤，使用辣根过氧化物酶标记的二抗在封闭缓冲液中稀释后，进行同样的处理，标记滤膜。
最后，将滤膜置于100mL新配制的DAB底物溶液中，显色反应约2～3分钟后停止，用水清洗以终止反应，然后进行照相。

通过分析显色条带的分子量和颜色强度，可以判断蛋白的表达水平。