双酶切简介

发布网友发布时间：2024-09-09 15:12

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热心网友时间：2024-12-02 06:26

双酶切反应，也称为同步双酶切和分步酶切，是一种生物实验中的常见技术，用于高效切割DNA。以下是这两种方法的简介：

1. 同步双酶切：这种方法的优势在于节省时间和资源。关键在于选择合适的缓冲液，如NEB提供的酶附带的NEBuffer，它们能确保每种酶在100%活性下工作。理想的缓冲液需充分考虑两种酶的活性差异，尽量在《内切酶在不同缓冲液里的活性表》和酶说明书指导下使用。如果酶在非最佳条件下活性降低，可能需要调整酶量和反应时间以保持效率。

2. 分步酶切：当找不到适用于两种酶的理想缓冲液时，需采取分步策略。首先用对盐浓度要求较低的酶进行酶切，再逐步调整浓度以满足另一种酶的需求，最后加入第二酶完成双酶切。这种方法可能需要更多的时间和步骤。

3. 特殊缓冲液使用：某些酶配有专门设计的缓冲液，尽管标准缓冲液可能适用，但为确保酶在特定条件下正常工作，可能需要调整。在非最佳缓冲液中，酶活性会减缓，可能需要增加酶量或延长反应时间，参照《内切酶在不同缓冲液里的活性表》查看具体活性。

在双酶切反应中，推荐如下几点注意事项：如果一种酶需要BSA（牛血清白蛋白），应在体系中加入；甘油的终浓度应控制在10%以下，以避免星号活性，可通过增加总体积来实现；有些酶组合不适用于同步法，需采用分步法，这些组合在相关资料中用“seq”标识。

扩展资料

做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。