包涵体分离

发布网友发布时间：2024-09-06 18:33

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热心网友时间：2024-09-28 04:31

当稳定且可重复的发酵过程建立后，提取包涵体成为必要步骤。包涵体位于细胞质或细胞外周质，需破坏细胞膜以释放它们。首先，通过冷却发酵液，利用离心或错流过滤收集细胞，细胞沉淀用含有特定离子强度（0.4-0.6M）的缓冲液悬浮，这一步骤需严格控制pH、离子强度、重金属浓度及氧化还原环境，这些因素对后续步骤至关重要。

由于包涵体对剪切力的耐受性较强，可以选择多种方法破碎细胞，如高压匀浆对大肠杆菌效果显著，可通过多次循环完全破碎细胞。酵母细胞由于细胞壁弹性较大，可能需要额外的循环，或在容器中添加玻璃颗粒。物理方法如超声，以及化学方法如溶菌酶和EDTA也可用于细胞破碎。

提取包涵体时，过滤或离心是常用手段，利用它们对包涵体物理特性的不同区分。过滤法因其成本低、易于放大而被证明有效，但可能面临过滤膜堵塞的问题。离心则利用包涵体密度大于细胞碎片的特性，分离两者。有时，通过预处理细胞（如加入非极性物质或去垢剂）可提高目标蛋白的收率，如人生长激素的包涵体。

工业生产中，连续离心技术是常见步骤，通过连续悬浮和离心，大部分包涵体可以分离出来，而细胞碎片逐渐去除。SDS-PAGE分析显示，离心方法能确保沉降物中蛋白质含量超过90%。在难以分离细胞碎片与包涵体时，化学方法如离子交换色谱能帮助复性蛋白质，避免膜蛋白污染或降解。常用的溶解膜蛋白的方法包括EDTA、去垢剂如Triton X-100，或者特定盐类。

然而，离心和高压匀浆可能产生泡沫，需在工业生产中避免。在线杀死细胞的方法，如在发酵罐中使用特定试剂，如苯乙醇等，能简化操作并节省时间，但可能影响蛋白质纯度或包涵体完整性。因此，这种方法需要谨慎使用，以确保目标蛋白的高效纯化。
扩展资料

包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。