Western blot 超全攻略—步骤详解与经验交流(一)

发布网友发布时间：2024-09-27 13:35

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热心网友时间：2024-10-25 19:51

Western blot，即蛋白印迹技术，是一种检测细胞或组织中特定蛋白表达的技术。其核心步骤包括总蛋白提取、蛋白定量、电泳分离、转膜及抗体检测。以下是详细步骤：

1. 总蛋白提取：无论是细胞还是组织，首先用蛋白裂解液（含RIPA、PI和PPI）进行裂解，细胞需刮取并离心收集上清液，组织则研磨后离心。提取后进行蛋白浓度测定。

2. 蛋白定量：通过BCA蛋白测定试剂盒，以确保每个样本的蛋白量一致。制作蛋白标准品，稀释待测蛋白，并进行显影反应和吸光度测定，计算蛋白浓度。

3. 免疫印迹：制备蛋白电泳胶，进行电泳分离，随后进行转膜，膜上会按分子量大小分离出不同的蛋白条带。转膜后进行封闭，防止非特异性结合，接着一抗和二抗孵育，最后进行化学发光剂显影，记录结果。

以上是基本操作流程，实践中还需注意细节，如蛋白裂解的完整性，电泳条件的控制，以及抗体孵育的优化。后续会分享更多实用技巧和常见问题解决方案。