几种蛋白质凝胶电泳方法的区别和用途
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发布时间：2022-05-10 01:00
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时间：2023-10-15 22:27
2、 琼脂糖凝胶电泳 ：琼脂糖凝胶电泳是一种以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳,其分析原理与其它支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用.琼脂糖凝胶具有网络结构,直接参与带电颗粒的分离过程,在电泳中,物质分子通过空隙时会受到阻力,大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅依赖于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大地提高了分辨能力.琼脂糖系天然的琼脂加工制得,天然琼脂是一种多聚糖,主要由琼脂糖（约占80%）及琼脂胶组成.琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷.而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,由于这些基团带有电荷,在电场作用下能产生较强的电渗现象.所以常用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、糖蛋白、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶等同工酶的分离和鉴定,为临床某些疾病的鉴别诊断提供了可靠的依据.与免疫化学反应相结合发展成为免疫电泳技术,用于分离和检测抗原.可对目前常用的琼脂糖进行某些修饰,如引入化学基团羟乙基,则可使琼脂糖在65℃左右便能熔化,被称为低熔点琼脂糖.该温度低于DNA的熔点,而且凝胶强度又无明显改变.以此为支持物进行电泳,称为低熔点琼脂糖凝胶电泳,主要应用于DNA研究.如DNA鉴定,DNA*性内切酶图谱制作等,为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段.
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂又称为共聚体的N,N’-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE).应用范围广,可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及少量的制备,还可测定分子量、等电点等.
4、等电聚焦电泳 ：等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的电泳介质来分离等电点(pI)不同的蛋白质的电泳技术.这是六十年代后期才发展起来的新技术,基本原理是在制备聚丙烯胺胶凝胶时,在胶的混合液中加入载体两性电解质(商品名Ampholine).这种载体两性电解质是一系列含有不同比例氨基及羧基的氨羧酸混合物,其分子量在300～1000范围内,它们在pH2.5～11.0之间具有依次递变但相距很近的等电点,并且在水溶液中能够充分溶解.含有载体两性电解质的凝胶,当通以直流电时,载体两性电解质即形成一个从正极到负极连续增加的pH梯度.如果把蛋白质加人此体系中进行电泳时,不同的蛋白质即移动并聚焦于相当其等电点的位置.好的载体两性电解质应具有以下特点：在等电点处有足够的缓冲能力,不易被样品等改变其pH梯度；必须有均匀的足够高的电导,以便使一定的电流通过；分子量不宜太大,便于快速形成梯度并从被分离的高分子物质中除去；不与被分离物质发生化学反应或使之变性等.Ampholine是一种常用的载体两性电解质.要取得满意的等电聚焦电泳分离结果,除有好的载体两性电解质外,还应有抗对流的措施,使已分离的蛋白质区带不致发生再混合.要消除这种现象,办法之一加入抗对流介质,用得最多的抗对流支持介质是聚丙烯酰胺凝胶.
等电聚焦电泳与其它区带电泳比较具有更高的分辨率,等电点仅差0.01pH的物质即可分开；具有更好的浓缩效应,很稀的样品也可进行分离,并且可直接测出蛋白质的等电点.所以此技术在高分子物质的分离、提纯和鉴定中的应用日益广泛.但是等电聚焦电泳技术要求有稳定的pH梯度和使用无盐溶液,而在无盐溶液中蛋白质易发生沉淀.
