Qpcr全步骤
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发布时间：2024-10-11 08:39
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时间：2024-10-17 08:43
1. 组织RNA提取（Trizol法）
每50mg组织使用1ml Trizol匀浆，最大转速瞬离匀浆管。将溶液转移到新的EP管中，室温放置5分钟。加入0.2ml（1/5Trizol）氯仿，剧烈混匀，室温静置5分钟，4℃ 12000g离心15分钟。吸取上层水相于新的EP管中（注意不要吸到中间层，一般1ml Trizol可以吸到400-500ul液体）。加入1.5倍体积的异丙醇（600ul），室温静置10分钟，4℃ 12000g离心10分钟。弃上清，注意不要弃去RNA白色沉淀，加入1ml 75%乙醇（用DEPC水配）洗涤三次，室温晾干5-10分钟。加入30ul DEPC水溶解RNA。
Trizol为苯酚+Rnase抑制剂，酸性。
2. RNA浓度测定及反转录
NanoDrop测定RNA浓度，放置于-80℃冰箱保存或直接进行反转录。
反转录体系：1000ng RNA，4ul 5× RT Master mix，RNase free water补足到20ul
混匀后放入PCR仪反应，条件如下：37℃, 30min → 85℃, 1min → 4℃, ∞
ddH2O将反转录后的cDNA稀释到2.5 ng/ul，-80℃保存。
3. Qpcr（48孔板）
内参：Gapdh，引物设计通过NCBI数据库（Gene-家鼠…）
体系：5ulSYBR，0.4ul前后引物，2ulcDNA，RNase free water补足到10ul
封膜离心跑PCR
数据处理：△△CT法，比较看情况使用t检验或方差分析。
