稳转株构建基本原理与步骤【新手入门】
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发布时间：2024-10-04 16:35
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时间：2024-11-03 15:48
选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中，可得到具有特殊性质或标志的细胞株，这些细胞株在培养过程中能保持其特性，且可培养至40-50代。对于人类肿瘤细胞，体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的细胞株称为连续性株或系。
在构建细胞株的过程中，通过外源DNA克隆到具有抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中。使用载体中的抗性标志进行筛选，从而得到可稳定表达目的蛋白或沉默特定基因的细胞株。真核表达载体的常用抗性筛选标志物包括新霉素、潮霉素和嘌呤霉素。
多克隆稳转株的荧光通常呈现强弱夹杂，从感染72小时后开始加入筛选药物，每隔2天重新换液加入筛选药物。药物筛选需持续至少14天，直至观察到荧光细胞比例达到100%。
稳定表达细胞株在多种研究中发挥关键作用。它们能够长期在目的细胞中研究基因功能，降低实验成本，便于长期实验。通过构建稳定株，可以实现更有效的基因干扰，筛选到合适的拷贝数进行实验研究，以及控制基因的时空表达，用于构建动物模型。
慢病毒是构建稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株的常用工具，因为它几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组中，进行长时间的稳定表达。构建稳定表达细胞株的过程包括筛选目的细胞的合适抗生素浓度、筛选目的细胞的合适病毒滴度、慢病毒构建与包装、慢病毒感染、特定抗生素筛选稳转细胞株和稳转细胞株的鉴定。
稳转株的构建是一个复杂且多平台合作的过程，涉及多种技术，容易受到多种因素的影响。在实践中，可能遇到的问题包括筛选效率低、细胞株稳定性差、筛选时间过长等。了解和解决这些问题对于成功构建稳转株至关重要。
