草酸铵结晶紫染液结晶紫染色法测定细胞数
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发布时间：2024-10-04 06:26
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时间：2024-10-04 12:43
首先，将5×104至10×104个WEHI-164细胞接种到96孔细胞培养板的每个孔中，培养液为含10%小牛血清的RPMI-1640，置于37℃和5% CO2的恒温培养箱中，让细胞贴附在底部，培养时间约2-3小时。
接着，使用RPMI-1640进行TNF标准品的10倍梯度稀释，根据需要对待测样品进行3-5倍稀释。每个孔加入0.1毫升的稀释标准品或样品，每个稀释度需有3个重复孔。对照设置为6孔，其中3孔加4μg TNF的RPMI-1640作为阳性对照，3孔加100μl RPMI-1640作为阴性对照。继续培养18-24小时后，移除培养液，用PBS进行一次轻柔洗涤，然后每孔加入0.1毫升10%甲醇溶液固定细胞30秒。
吸去甲醇后，每个孔加入0.1毫升结晶紫染液，在室温下静置20分钟。轻轻甩去染液，用蒸馏水清洗，将培养板放置在吸水纸上吸干水分，或在37℃下烘干。实验板可长期在室温下保存以备后续测定。
在测定前，每个孔添加0.1毫升33%醋酸脱色，充分振荡后，测量570nm处的光吸收度。通过绘制样品稀释度与光吸收度的关系图，比较标准品曲线与待测样品曲线，以此来评估待测样品中细胞因子的活性水平。
