实时荧光定量pcr仪实时荧光定量PCR技术原理

发布网友发布时间：2024-10-04 04:20

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热心网友时间：2024-10-19 18:47

实时荧光定量PCR技术，简称real-time Q-PCR，是一种在PCR反应体系中嵌入荧光标记物，实时监测PCR进程并进行定量分析的方法。其发展历程中，有两个关键发现推动了技术的进步：

首先，90年代早期，Taq DNA聚合酶的5'核酸外切酶活性的发现，使得能够通过降解特异性荧光探针间接检测PCR产物，从而实现了实时监测。

其次，荧光双标记探针的引入，使得PCR反应在密闭反应管中可以全程实时监控，大大提升了效率。这两个发现的融合，配合仪器和试剂的商业化，使得real-time Q-PCR技术在科研领域广泛应用。

在PCR反应中，DNA拷贝数随循环数呈指数增长，当反应进入平台期后，不再以指数方式生成模板。传统PCR中，通过凝胶电泳和荧光染色检测产物，存在定量不准确的问题。相比之下，real-time Q-PCR通过实时监测荧光信号的变化，形成曲线。在PCR反应的指数期，荧光信号与背景有明显区别，这时可测定模板的初始含量。设定荧光信号域值（如前15个循环的荧光信号作为基准，通常为10倍标准偏差），当信号超过此值，即为有效信号，对应的循环数称为Ct值。Ct值与模板起始拷贝数呈对数关系，Ct值越小，起始拷贝数越多。通过标准品的已知起始拷贝数绘制标准曲线，可以将未知样本的Ct值映射到起始拷贝数，实现定量分析。

扩展资料

实时荧光定量pcr仪，由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。