分析微生物测序数据的知识点

发布网友发布时间：2024-10-04 01:02

共1个回答

热心网友时间：2024-11-13 03:06

生物学重复在微生物测序实验设计及后续信息分析中极为关键，它通过样本的重复设置实现以下几方面的重要作用：消除组内误差，增强结果可靠性，以及检测离群样本。建议在自然环境（如土壤、根系、植物等）及模式动物（如大鼠、小鼠等）中，每组至少设置6个生物学重复，通常推荐10个重复以确保数据的稳健性。对于人类肠道、粪便等个体差异较大的样品，每组至少需30个重复，以避免组内差异掩盖组间差异。

数据库是微生态研究中不可或缺的部分，它们为16S rRNA测序序列的物种分类提供基础。常用的数据库包括RDP、SILVA、Greengenes以及NT-16S，每种数据库在更新频率、序列信息的完整性以及特定功能上各有侧重。RDP数据库因其更新较快、序列信息全面而备受青睐；SILVA数据库因其及时的更新成为常用的参考数据库之一；Greengenes数据库在较长时间内保持稳定，用于嵌合体去除的参考，同时也是PICRUST软件的开发基础，适用于16S功能预测分析；NT-16S数据库则是联川特色数据库，专用于基于RDP注释结果进一步扩展的种水平注释。

引物选择是测序过程中的关键步骤，传统方法中的27F和1492R引物虽能扩增出完整的16S rRNA基因全长序列，但受限于二代高通量测序的读长*，其适用性逐渐降低。目前环境微生物组学常用的测序区域为V3-V4、V4-V5或单个V4区。常用的V3-V4区通用引物为338F/806R，此引物能有效覆盖目标区域。

物种注释过程面临着数据库*和测序长度的挑战，理论上，所有微生物序列都可以在种甚至菌株水平进行鉴定，但实际中由于微生物种类繁多以及测序长度的*，注释精度受到一定影响。No_Rank表示分类信息不明确或分类名称缺失，Unidentified表示分类学比对置信度低于设定阈值或无分类信息的reads，Others则表示reads注释到多个数据库或相对丰度小于1%的物种。在作图分析时，Others通常指包含上述注释结果以及相对丰度较低的物种。

操作分类单元（OTU）是微生态研究中简化数据结构和评估微生物多样性的重要工具。OTU是基于高变区序列比对的分类单元，通常将相似度大于97%的序列聚为一类。通过OTU聚类分析，不仅可以量化样品中的微生物多样性，还能揭示不同微生物的丰度分布情况。alpha多样性指数，包括Observed species、Chao1、Shannon和Simpson指数，用于描述特定环境或生态系统内的物种丰富度和均匀度。beta多样性指数则关注不同群落之间的物种组成差异，反映生境变化的程度或指示生境被物种分割的程度，用于比较不同生境的多样性。