mRNA差别显示技术操作步骤

发布网友发布时间：2024-10-07 18:10

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热心网友时间：2024-11-25 12:12

操作mRNA差别显示技术的步骤如下：

首先，从样本中提取总RNA，参照Northern杂交方法（1）。

接着，进行第一链合成：取2μg总RNA，加入1μl cDNA合成引物，补足至5μl，分别标记为1A、2A、PC A等。PC作为阳性对照。混合均匀后离心，然后在70℃孵育3分钟，再在冰浴中冷却2分钟。

接着，准备dNTP混合液，每5μl反应液中包含5×第一链缓冲液、dNTPs、MMLV逆转录酶等，按照指定比例加入。在42℃条件下进行1小时的逆转录反应，然后在75℃下终止反应，冷却后置于冰上离心。

将反应液转移至新管中，用ddH2O稀释cDNA，将样本和对照分别转到1B、2B等新管中，保存在-20℃备用。

进行dd-PCR时，以P1和T9为例，设置不同的反应体系，包括实验组和对照组。在PCR管中加入cDNA样本、引物以及预配的PCR试剂混合液，执行PCR扩增，循环参数设定在GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600上。

扩增结束后，进行电泳和放射自显影，使用6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离。取样后进行差异条带回收，利用原引物进行再扩增，通过电泳确认产物，进一步进行Northern杂交验证基因的存在。PCR产物还需进行TA克隆、DNA序列测定和检索分析，以获得完整的基因信息。