SDS-PAGE电泳及Western试剂配制protocol
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发布时间：2024-10-02 18:39
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时间：2024-10-17 16:38
首先，需准备1.5 mol/L Tris (PH8.8)溶液。在1L烧杯中称量181.7g Tris，加入约800 ml去离子水并充分搅拌以溶解。然后用浓盐酸调节pH值至8.8，注意溶液需冷却至室温再调定pH值，避免温度变化对pH值的影响。定容至1L后，进行高压灭菌并室温保存。
接着，配制1 mol/L Tris (PH6.8)溶液。称量121.1gTris，加入约800 ml去离子水充分搅拌溶解。按照所需pH值添加浓盐酸调节，并定容至1L。同样需在溶液冷却至室温后再调定pH值，避免温度对pH值的影响。如溶液呈现*，需更换质量更好的Tris。
配制丙烯酰胺溶液。在烧杯中称量所需试剂，并加入约60 ml去离子水充分搅拌溶解。定容至100 ml后，使用0.45 µm滤膜过滤杂质，于棕色瓶中4 oC保存。注意丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套等防护措施。聚丙烯酰胺无毒，但需谨慎操作，防止含有未聚合成分。
配制30％SDS溶液。称量10 g高纯度SDS置于烧杯中，加入约800 ml去离子水加热溶解。滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2，定容至100 ml并室温保存。
准备10％过硫酸铵溶液。称量1 g过硫酸铵，加入约10 ml去离子水搅拌溶解。存储于4 oC，其有效期约为两周左右。
制作不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液，室温保存并临用前加入DTT。
配制Takara公司Catalog-N5上的5×SDS-PAGE Loading Buffer。按照配方称量所需试剂于10ml塑料离心管中，溶解后定容至5 ml。小份分装后于室温保存，使用前加入25 ul的2-ME，以延长保存时间。
配制1 mol/L DTT溶液，加入20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌，保存于-20oC。
配制3 M醋酸钠（NaOAc）溶液。称取40.8 gNaOAc·3H2O于烧杯中，加入约40ml去离子水搅拌溶解，加冰醋酸调节pH值至5.2，定容至100 ml后高压灭菌并室温保存。
制备5×Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）。称量所需试剂置于烧杯中，加入约900 ml去离子水搅拌溶解，定容至1L后室温保存。
制备Transfer Buffer（转膜缓冲液）。先配制1M Tris base，再加入适量甘氨酸、甲醇与水，调至合适pH值。置于4oC保存备用。
准备丽春红S储存液（10×），用于染色实验。具体操作为按照一定比例稀释储存液与去离子水，即成丽春红S使用液。
此外，还需根据实验需求制备多种缓冲液，如10X TBS、Wash Buffer TBS/T、Blocking Buffer、Primary Antibody Dilution Buffer等，具体配制方法参照相关实验手册或专业文献。
以上步骤详细介绍了SDS-PAGE电泳及Western实验中所需试剂的配制方法，确保了实验的准确性和有效性。
