实验技术 | 如何做出更漂亮更准确的细胞周期检测数据

发布网友发布时间：2024-10-03 05:23

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热心网友时间：2024-11-05 08:36

细胞周期（cell cycle）是细胞分裂过程的重要组成部分，涉及遗传物质复制与均等地分配给两个子细胞的过程。细胞周期主要分为分裂间期与分裂期（M期），其中分裂间期又细分为G1期、S期与G2期。在评价细胞增殖功能中，细胞周期研究至关重要，它反映了细胞增殖速度。研究细胞周期对深入理解生物生长发育及肿瘤生长控制具有重要意义。细胞周期失调是癌症的特征之一，肿瘤细胞周期分析对于肿瘤生物学特征及药物作用机制的研究具有关键作用。在肿瘤病理学中，S期细胞比率常作为肿瘤增殖状态的指标。肿瘤治疗中，G0期细胞对化疗不敏感，控制其进入细胞周期，提高化疗敏感性，是防止癌转移与扩散的重要策略。

测定细胞周期的方法多样，包括同位素标记法、流式细胞仪法、基于细胞成像的荧光检测法、BrdU掺入法等。其中，流式检测法因其适用于大量样品快速分析单个细胞的多种特性，成为目前最常用的测定方法。流式检测的原理在于，细胞周期不同时期，细胞核内DNA含量存在差异，G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期介于二者之间。使用核酸染料染色后，检测荧光强度可判断细胞所处的时期。流式中常用碘化丙啶（Propidium，简称PI）与DNA结合，其荧光强度反映了细胞内DNA含量：DNA含量多，荧光强度高；DNA含量少，荧光强度低。

实验步骤包括：（1）细胞培养：选取对数生长期的细胞，按特定密度接种，进行处理。建议选择6孔板操作，细胞给药密度在60%左右。（2）收集细胞：倒去培养基，用胰酶适度消化，离心收集细胞沉淀，弃去上清。（3）细胞固定：用预冷PBS洗涤1-2次，加入300μL PBS重悬，避免细胞成团。逐滴滴入预冷的75%乙醇，搅拌，置于-20°C冰箱固定过夜。（4）细胞染色：取出标本，离心，弃上清，加入溴化乙锭（PI，50μg/mL）与RNase A（100ug/mL），避光孵育60min。（5）流式分析：使用流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

结果图解读：分析依据细胞DNA含量（横坐标）进行，右侧数字表示直方图特征与软件模型的比较。G2/M期细胞的DNA含量是G1期的两倍，形成高斯峰。CV值表示峰的宽度，一般在5%左右被认为理想。RCS值在1~3之间为理想分布，高于5则表示异常。

在细胞周期检测中，CV值过大可能导致异常结果，常见原因包括仪器因素与样本制备及染色过程的误差。G2/M期缺失可能由细胞状态、生长条件或密度过高引起。优化培养条件与合理操作可避免此类问题。实验要点与注意事项包括：确保PI的使用与清洗，避免后续实验干扰；合理选择细胞状态与培养条件；注意细胞固定与染色过程的细节。