文献解读:荧光原位杂交(FISH)

发布网友发布时间：2024-10-04 20:29

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热心网友时间：2024-10-05 18:47

荧光原位杂交（FISH）技术在细胞遗传学领域扮演重要角色，已广泛应用在研究与诊断中。相比于放射性和免疫细胞化学原位杂交方法，FISH技术因显著提高速度和空间分辨率，同时具有稳定的标记探针，能长期储存，且不再需要分析中期染色体上的非特异性信号，而具有明显优势。

一、关键步骤详解

1. 变性寡核苷酸引物（DOP）-PCR合成DNA探针

该方法旨在扩增和标记大基因组区域，生产全染色体涂料（WCP）或部分染色体涂料（PCP）。模板通常是通过流动分选的染色体或染色体微区。整个过程包括两轮不同PCR：第一轮扩增染色体DNA，第二轮则允许掺入标记的核苷酸。

2. 荧光原位杂交

此步骤涉及将变性杂交混合物滴在载玻片上，随后盖上盖玻片并密封。载玻片在42°C的水浴中过夜漂浮，或放置在42°C的培养箱中。取出盖玻片，轻轻去除橡胶溶液，避免移动载玻片，以免染色体和细胞核受损。清洗载玻片以去除未结合或非特异性结合的探针片段。

二、FISH中常用荧光染料

三、FISH技术的发展

1. Tyr-FISH：采用过氧化物酶偶联抗体作为信号检测的第一层，随后使用荧光染料标记的酰胺作为过氧化物酶底物，在原位生成并沉积大量荧光染料。此信号方法系统显著提高FISH的灵敏度。

2. 三维FISH：减数分裂细胞在缓冲液中轻轻固定，随后从花药中轻轻挤出花粉母细胞，嵌入光学透明的聚丙烯酰胺中进行染色和成像。FISH图像堆叠拍摄并组合成单一三维图像。此技术能很好地保存染色体结构，允许精确定位细胞核内染色体上的DNA探针。

3. 超延伸染色体上的FISH：经过温和的蛋白酶K消化后，植物染色体被拉伸到100倍以上大小。拉伸染色体上的FISH显示更亮信号，由于探针更容易接近拉伸染色质。此技术提供高达70kb的分辨率。

4. FISH作为染色体鉴定工具：重复DNA元件在单个染色体上产生特定FISH信号模式。通过标记两个或多个重复DNA探针组合可增加分辨率，例如识别六倍体小麦的所有21条染色体。

作为卡梅德生物（KMD Bioscience）的FISH技术服务，我们提供从探针设计、样本处理、杂交检测、基因表达研究到数据分析等一站式服务，积累了丰富的经验。

参考文献：

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