酵母双杂交的改进版本
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发布时间：2022-05-20 14:26
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时间：2023-08-11 23:42
反式转录因子抑制（RTA）系统与经典的Y2H相反，诱饵-猎物的互作将抑制转录因子激活报告基因。诱饵蛋白X与Gal4的DBD融合后具有转录因子的激活活性，另一个蛋白Y与一种转录阻碍物（Tup1p）的抑制结构域（RD）融合。如果两者可以相互作用，报告基因的转录就会被抑制[60]。RTA系统已被用于研究哺乳动物basic helix-loop-helix proteins MyoD和E12、protooncogenic transcription factor c-Myc与the putative tumor suppressor protein Bin1蛋白间的相互作用。同时，该系统还被用于筛选与各种转录激活因子的相互作用，如单纯性疱疹病毒（HSV-1）*蛋白VP16 [60]，c-Myc及雄性激素受体。
SOS和RAS募集系统 (SRS and RRS)是Ras信号通路转录的旁路（are bypassing the transcriptional readout by using the Ras signalling pathway），在酵母细胞和哺乳动物中是相似的。Ras被定位在质膜上，可通过酵母中的Cdc25或哺乳动物中的Son of sevenless (SOS)脒基交换因子进行GDP-GTP的转换。Ras被激活后会引发下游信号转导途径。此处描述的Y2H系统使用Cdc25-2温度敏感型酵母菌株，因为Cdc25-2没有活性，不能激活Ras信号转导途径，导致此菌株在高温（36 ℃）下不能生长。通过Y2H系统中选择性激活Ras，可以使其温度敏感表型消失。
SCINEX-P系统（胞外蛋白间的互作筛选）由Urech等于2003年发布，使我们可以分析ER内的氧化环境中的蛋白互作。该系统利用酵母未折叠蛋白反应（UPR）的信号途径。ER中错误折叠蛋白的积累会诱导酵母ER I类跨膜蛋白（Ire1p）形成二聚体，后者诱导Hac1p转录，其产物可激活分子伴侣的转录。在SCINEX-P系统中，目的蛋白与缺少位于腔内的N末端寡聚化结构域的Ire1p突变蛋白（ΔIre1p）融合。两种杂合蛋白的互作会引起Ire1p蛋白二聚体的重构，从而激活UPR下游信号转导过程。为了检测蛋白互作，Hac1p UPR元件被引入报告基因的启动子上。此Y2H系统被成功地用于分析蛋白质二硫键异构酶ERp57与钙联蛋白间（这两个蛋白都在ER中折叠）、抗原与抗体间的互作。
*化泛素系统由Johnsson和Varshavsky于1994年设计，可用于测定细胞质基质蛋白间的互作检测；后来又被扩展为膜蛋白间的互作筛选。泛素是一类小蛋白，对于细胞中错误折叠的蛋白是十分重要的。蛋白通过与一个多聚泛素蛋白链共价结合被标记为蛋白酶体的降解对象。该链将被泛素特异性蛋白酶（USP）首先从蛋白上降解。*泛素化Y2H技术基于泛素可*为两个独立的片段。已有的研究显示泛素可*为N端（Nub）及C端（Cub），并且这个片段间有亲和性，可能自发形成与原泛素类似的蛋白。通过在Nub（NubG, NubA）的点突变（I13G or I13A ）可使Nub和Cub的自发组装无法进行。
在这两种突变体中，只有两部分由于NubG/A和Cub互作而被拉到足够接近的距离时，才能发生有效地结合。重构的*化泛素可被USPs识别，然后切掉与Cub C端融合的报告蛋白。最初的系统使用二氢叶酸还原酶作为报告基因，后者产物可通过SDS-PAGE检测。然而，由于需要使用免疫共沉淀和电泳分离，阳性克隆的鉴定十分不便。
膜反式转录激活因子*泛素(MbY2H)系统使用人工转录因子（LexA-VP16）作为与泛素相连可被水解的报告蛋白，可分析ER膜蛋白间的相互作用。一旦泛素被重组，LexA-VP16就被释放到核中并激活报告基因的转录（如HIS3，LacZ）。这种转录激活方式放大了蛋白的互作反应，对瞬时互作的检更敏感、更方便。此系统已被成功用于检测不同种类膜蛋白间的互作反应。*泛素系统已被广泛应用于cDNA文库筛选和大规模矩阵法中。
近期，改进后适用于胞质蛋白互作筛选的MbY2H系统已被发布。在此改进方案中，诱饵载体上包括Cub和转录因子，并且由于融合了ER膜蛋白Ost4p，使此融合蛋白锚定在ER膜上。
