多克隆抗体的分离纯化
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发布时间：2023-06-22 15:49
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时间：2024-12-11 20:09
一、批量提取法
称取DEAE-纤维素(DE32或DE52)50g，置于1000ml烧杯中，先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸盐缓冲液(PB)平衡。将水分抽干，或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤，收集湿纤维素，以降低其离子强度。按1ml血清加湿重5g DEAE纤维素，经过充分搅拌，置4℃吸附1h。上清液可再如此处理一次，即获得较纯的IgG。该法提取IgG简便，既可小量提取，也可大量制备。
二、Tris-Cl离子交换层析法(Ion-exchange chromatography)
材料和试剂
1. DE32或DE52纤维素。
2. HCl；NaOH；0.01～0.05mol/L，pH8.0 PB；0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl；0.5mol/L NaCl。
3. 待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
4. 1.5×50cm 层析柱；透析袋；紫外分光光度计及其他透析和层析所需的试剂和器材。
操作步骤
1.DE52纤维素的处理：DE52经酸、碱处理，0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。
2. 装柱：将层析柱固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出口接一细塑料管并关闭出水。将浸泡于0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5cm高时，吸除0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松开出水口螺旋夹，控制流速1～2ml/min，同时连续加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片。
3. 平衡：松开出水口螺旋夹，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速为15滴/min，待流出液与洗脱液之pH值达到一致时，停止平衡。
4. 待提取样品的准备：将蛋白装入透析袋里，置4℃冰箱，对0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析过夜。
5. 加样、洗脱与收集：用吸管吸去柱面液体，以毛细吸管沿柱壁加入样品，样品体积相当于柱床体积的1％～2％，蛋白浓度为50～70mg。启开出水口螺旋夹使样品缓慢进入柱床内，并用少量洗脱液清洗柱壁；待液体进入柱床后，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl洗脱，控制流速为14～16滴/min。分部收集器收集，紫外监测，或人工收集，以紫外分光光度计分别测定每管280nm OD值，描绘洗脱液峰。
6. 浓缩：将洗脱液的280nm OD上峰段与下峰段各管分别合并，装入透析袋，以PEG浓缩至所需体积。
三、Tris-PO4 离子交换层析法
该法在上述方法的基础上稍加改良，即通过梯度洗脱，可用于血清中IgG和IgM的提取。
材料和试剂
1. DE32或DE52纤维素。
2. 待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
3. 1.5×50cm 层析柱；透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。
4. 梯度洗脱液包括：0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO4 ；0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 ；0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4 。
操作步骤
1. 蛋白标本对0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 透析。
2. DE52装柱，并以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 平衡。
3. 加样，以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 洗脱，紫外监测直至洗脱液280nm OD回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。
4. 以350ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 洗脱，这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM。
5. 以125ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 和125ml 0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4 梯度洗脱，总量收集250ml；重复步骤（5）。
6. 根据280nm峰值合并蛋白峰，透析浓缩和保存同上。
用过的DE52可用0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl梯度洗脱回收。再用蒸馏水洗至中性，加入0.02％叠氮钠于4℃保存备用。
