肝脏组织蛋白裂解
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发布时间：2023-09-07 23:07
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热心网友
时间：2023-09-28 06:05
整体来说，肝脏组织是非常好裂解的，用匀浆的方法裂解之后，还会有一些组织无法裂解，这部分是因为被肝脏被膜包裹，即便是再增加几个cycle也不一定能完全裂解，当看到裂解液变成偏血色的*时，说明蛋白浓度已经是很高了。
关于组织的大小 ，我其实摸索了好几次，有人说“小指甲盖那么大加1ml裂解液”，有人说“研钵研磨后取一，勺，加500ul”。几次做下来，其实我的蛋白浓度都不低，但是蛋白浓度都不高，或者因为加了巯基乙醇而无法用BCA测浓度。后来我才知道，是因为自己没有做标曲！！！问了有经验的人，他们甚至会每裂一次组织就做一次标曲。昨天的样品，一起做了标曲之后，终于在100ug上样量的情况下，也不会超过20ul，可以用1.0mm的胶板配15孔胶了。我此次大概是取了两片小肝叶的大小的组织进行匀浆。
组织蛋白样品制备的详细步骤：
准备匀浆管，加珠子；（下次可以多加四五个小珠子，约七八个）
将1*SDS lysis buffer加入管中，做好标记，加入管中；（裂解液要提前预冷，并且匀浆管的适合体积应该在1-1.5ml之间，所以每次加1ml即可，取得组织大小也相差不要太大）
然后准备组织；（大概清楚是多大的组织了，加1ml裂解液）
全程放在冰上，下楼匀浆；（6000rpm，匀浆20s，stop 10s，2cycles，但可能匀浆不是很彻底，可以多加一两个cycle）
12000rpm，5min；（四度离心，SDS没有那么快析出，蛋白要保持低温）
离心之后取上清，转移到新的1.5mlEP管中；
放在冰上15-30min，也可以在四度转15-30min，使细胞充*解；
测浓度，37℃，30min（知道50ug或100ug大概的上样量）；
然后取出适量体积的蛋白裂解液，用1*SDS lysis buffer调节浓度；（注意不要稀释太多倍）
加入loading buffer，100℃，煮5min；
上样；
样品在-20摄氏度以下拿出来的，室温几分钟即化开，混匀，立即上样即可，不用反复煮。
注意事项：
无论是蛋白制备还是跑胶转膜封闭一抗二抗，每一步都很关键，哪一步做不好都会影响最终显影时的结果。包括最简单的配胶步骤，胶板洗的干不干净，配胶是否混匀，用什么溶液去压线，胶孔中的残胶是否去除等等，都是至关重要的步骤，这关系到你能不能跑出好看的结果。
我甚至觉得，做出一个好看的WB，对实验技术是一个很大的考验！
