感受态细胞的制备时有什么注意事项

发布网友发布时间：2022-04-24 13:36

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热心网友时间：2022-04-28 04:51

感受态细胞的制备时的注意事项：

1、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue 的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一
个非常理想方法。

2、在保存感受态时，DMSO 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

3、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。

4、冻存的感受态用一次拿一管，不要反复冻融。化冻之后立即使用，不要冰上放太久。

5、操作时可以轻弹轻甩，尽量避免用移液器吹吸。

扩展资料：

感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。

参考资料来源：百度百科--感受态细胞

热心网友时间：2022-04-28 06:09

（1）质粒DNA的质量和浓度：

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
（2）感受态细胞的质量：
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃
（3）细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
（二）感受态细胞转化中的影响：
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液*头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。