氨基酸分析在各个领域的重要应用是什么?

发布网友发布时间：2022-04-25 04:16

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热心网友时间：2023-07-09 04:11

楼主你好：由于近年来化学领域的快速发展氨基酸分析在生物化学、药学和临床研究上都有着广泛而重要的应用. 氨基酸的分离,尤其是氨基酸对映体的分离一直是海内外的研究热门.在手性分离这一领域,高效液相色谱法（HPLC）一直是最广泛使用的方法. 目前高效液相色谱分离手性化合物主要有两种方法:一种是直接分离法,也就是利用手性固定相直接分离手性化合物对映体. 王亚丽[1 ] 等曾用纤维素-三（ 3 , 5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC）手性柱在正相模式下拆分了3 种外消旋氨基酸的衍生物. 另一种是间接分离法,目前主要是柱前衍生化法———将手性化合物柱前衍生化,将对映体转化为非对映体,进而使用常规柱完成分离分析. 离多种氨基酸的对映体,将化学计量学方法引入丝氨酸对映体重叠峰的分析,可以一次性地定量分析多种氨基酸对映体.所用衍生剂为邻苯二甲醛（OPA）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC） [2 ,3 ] . NAC是一种手性硫醇,其它手性硫醇如N-乙酰-D-青霉胺（NAP）、N-异丁酰-L-半胱氨酸（ IBLC）、N-异丁酰-D-半胱氨酸（IBDC） [4 ] 也可与OPA 一起做为衍生剂. 1. 1 试剂与仪器 DL-丝氨酸（上海丽珠春风生物技术有限公司） ;L-丝氨酸、β丙氨酸、DL-丙氨酸、L-丙氨酸、DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、DL-缬氨酸、L-缬氨酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠、乙酸钠（中国医药团体上海化学试剂公司）;邻苯二甲醛（以下简称OPA ,中国医药团体上海化学试剂公司） ;N-乙酰-L-半胱氨酸（以下简称 NAC ,Lancaster 公司） ;甲醇（HPLC 级,Merck 公司） ;高纯水. 除甲醇和水外其他试剂均为分析纯. 美国Aglient HP1100 高效液相色谱仪（DAD 检测器） ,ChemStation 化学工作站. 美国Aglient8453 UV - Vis 光谱仪. 1. 2 样品预处理[5 ] 各氨基酸样品配制成浓度约为0. 01 M 的水溶液.硼酸缓冲液的配制:硼酸（0. 01 M）、氢氧化钠（0. 01 M）和水按体积比50∶45∶5 配制得到pH 为9. 3的硼酸缓冲液.衍生剂的配制:将53. 3 mg OPA溶于50 mL 甲醇得到OPA 甲醇溶液. NAC 溶于硼酸缓冲液中（0. 00286 M） . 取12 mL OPA 甲醇溶液、10mL NAC 硼酸溶液,添加3 mL 硼酸缓冲液至25 mL ,得到OPAPNAC 衍生剂. 1. 3 衍生反应将0. 1 mL 氨基酸与5 mL OPAPNAC 衍生剂彻底混合5 min 后过滤进样分析. 1. 4 色谱前提 ZORBAX Eclipse XDB - C8 色谱柱（4. 6 mm 3 150mm , 5μm） . 不同比例的甲醇和0.05 M醋酸钠水溶液为活动相,流速1 mLmin - 1 ,进样量20μL. 所有的色谱分离均在室温下进行, 在线检测波长为334 nm ,DAD 检测波长范围为190～400 nm. 非负矩阵因子分解（NMF）计算截取的数据波长范围为320 nm～390nm. 1. 5 数据处理方法本实验采用非负矩阵因子分解（NMF） [6 ] 计算两个混合组分的纯谱. 非负矩阵因子分解是在“非负” *约束前提下的一种矩阵分解新方法,它的基本思路是将非负矩阵V 分解成两个非负因子矩阵W 和H.NMF 算法中采用了乘法更新公式（见公式（1）和（2）） ,所以不必采用其它*前提即能保证分解结果“非负”. 2. 1 氨基酸对映体的分离氨基酸与衍生剂的反应天生异吲哚类产物[7 ] ,反应方程式见图1. 由紫外丈量得到的图谱可看出, 此类衍出产物在230 nm 和334 nm 处各有一个最大吸收 . 但因为230 nm 处较易受干扰,故在色谱实验中除了记实全波长数据外,选择334 nm 作为检测波长. 下文中所提到的氨基酸色谱峰均为其经由上述衍生化后所得到的衍生物的色谱峰. 结果表明,在甲醇∶醋酸钠溶液为30∶70 的淋洗前提下,除DL-丝氨酸的两种对映体有部门重叠外,DL-丙氨酸、DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸的对映体能得到基线分离,但是DL-缬氨酸的两种对映体出峰时间为17 min 和25 min ,DL-苯丙氨酸的两种对映体出峰时间为38 min 和43 min.此分离前提下,不仅铺张活动相,而且峰形不理想. 假如将活动相的比例调节至45∶55 ,固然可使DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸的对映体在10 min 内洗脱出峰,但将使DL-丝氨酸及DL-丙氨酸完全或部门重叠. 更多质量检测、分析测试、化学计量、标准物质相关技术资料请参考中检所标准品对照品 www.rmhot.com 考虑到DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸留存过强的情况,操纵中采用了简朴的梯度淋洗,在前三种氨基酸全部出峰后,改变活动相配比使DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸快速出峰. 淋洗方案如下:在0～6 min 内保持甲醇∶醋酸钠溶液为30∶70 不变,在6～7 min 由此比例线性变化至45∶55 ,在7 min 以后保持45∶55不变. 各对对映体的定性采用左旋光学纯标样通过内标法确定.β丙氨酸没有手性,没有对映异构体,只有一个色谱峰. 2. 2 波谱解析法的使用尽管采用梯度洗脱,此谱中仍有一对重叠峰—丝氨酸的两个对映体. 在这种情况下, 假如要定量分析此体系,知道两组分的实际峰面积是必须的. 我们使用非负矩阵因子分析解析出两组分的纯谱 ,但此结果与实际纯谱还存在一个系数关系,即AXD-Ser BXL-Ser = YDL-Ser .为得到两组分实际的纯谱,我们用最小二乘回归（ least squaresregress , LSR）来计算系数A 和B,得到的结果如下 : A = 72. 59 ; B = 75. 98. 此系数乘以各自组分的纯谱即为两组分的实际峰面积. 2. 3. 1 尺度曲线的建立采用单一对映体标样在不同浓度值下的色谱峰面积或峰高建立尺度曲线. 实验中选用L-丙氨酸和L-苯丙氨酸作为两种标样,L-丙氨酸对应甲醇∶醋酸钠= 30∶70 的色谱前提,L- 苯丙氨酸对应甲醇∶醋酸钠= 45∶55 的色谱前提. 以浓度对峰面积或峰高进行线性拟和,得到尺度曲线方程 . 通过此方程可以测定混合样品中两个标样组分的浓度. 2. 3. 2 其它组分相对浓度预告在同样的色谱前提下,体系中各组分的含量比与其色谱峰面积比成线性关系. 各组分的峰面积和所占面积面分比结果见表1 ,其中D-丝氨酸和L-丝氨酸的单峰面积是根据上述化学计量学方法计算而得.