杨树菇菌种分离的方法有哪些?

发布网友发布时间：2023-07-27 09:11

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热心网友时间：2024-10-14 08:14

杨树菇和大多数木生型菇菌一样，其纯菌种可用孢子分离法、组织分离法或菇木分离法获得。通常以交叉使用前两种分离方法为主。前面已经说过，我国杨树菇的单孢子菌株具有结实能力，因此在进行孢子分离时，可采用单孢分离法获得纯菌种，经过出菇鉴定后，挑选优良菌株作母种使用。或在生产上使用的优良菌株中，选取生长健壮、形态正常、无病虫害的幼嫩子实体作为分离材料，按照组织分离的无菌操作程序分离接种。以下简要介绍单孢分离法和出菇鉴定要求。

1.单孢分离法

（1）单孢稀释分离法将选择好的种菇置于孢子弹射分离装置内进行孢子弹射，收集孢子（弹射分离方法见黄伞有关部分）。然后对收集的孢子用无菌水进行稀释分离。将稀释后的孢子悬浮液滴在载玻片上，放在低倍镜下进行检查，至每滴中有4～5个孢子为合适。接种时，用注射器吸取孢子悬浮液，将试管棉塞拔松，沿试管壁插入注射器针头，每支试管注入1～2滴孢子悬浮液，转动试管，使孢子均匀地分布在培养基表面，静置1～2小时后，移入温箱培养。

也可将已稀释的孢子悬浮液注入培养皿内，每个培养皿加1～2滴即可，然后倒入已溶化并冷却到45℃的琼脂培养基，厚0.5厘米，在工作台上左右旋转混匀，静置1～2小时，倒转培养。孢子萌发后，将单孢菌落连同少许培养基移接到试管内培养。

（2）单孢定位切割分离法浙江省农业科学院园艺研究所范雷法等（1996）曾介绍一种自制简易定位切割器，能快速、准确的分离单孢菌落。定位切割器制作方法如下：选用普通圆珠笔芯塑料空管一小段，长2～3厘米，用刀片将空管一端削成薄片，另一端用火熔化压成平头，用一只乳胶指套，在其中间打一孔，插上上述做好的塑料平头，将其固定在40或100倍显微镜的镜头上，使其紧密接触。

切割器的尖头部分，要削得薄、长而光滑，使之能切割完好，为粘连切割圈外的培养基；切割器与物镜固定要紧，且位置在正中，使物镜与笔芯空管处于同一轴心上。做成之后用以下方法进行校正：在载玻片或培养皿上倒入一薄层（厚2～3毫米）水样琼脂培养基，凝固后，用带有定位器的物镜镜头，轻轻转动上下调节器，使定位切割器下降，并切割到培养基的2/3处，勿切割到底，以免损坏定位器和琼脂培养基的表面；再转动调节器，使定位切割器上升，用低倍镜观察定位切割器切割后的培养基块是否在视野正中，如果不在正中，则应对乳胶指套的相对位置进行调节，至适合要求。如显微镜是以载物台作为上下调节的，也可用同样方法校正。一般普通笔芯内径在2毫米左右，约是低倍镜的2倍左右视野。定位切割器使用前浸泡在酒精内消毒备用。

按常规方法将孢子稀释后制成PDA琼脂平板，在低倍镜下检查，若确认为单孢，则可改用定位切割器进行切割，按上述方法在同一培养皿内将单孢切割完毕。再将金属针打扁，使尖端平而稍弯曲，用来在培养皿内挑取切割块，要尽量避免碰到圈外培养基，然后移置在斜面上培养。

（3）试管稀释点样法用灭菌接种针在培养皿内蘸取少量担孢子，或用接种针直接从菌褶上轻轻刮取少量孢子，洗入试管内的无菌水中，充分摇动，使之均匀分散。然后用灭菌接种针蘸取1滴孢子液，放在载玻片上，用低倍镜检查，如果每滴水中仍有3～4个孢子，应继续稀释，至每滴中含1～2个孢子为止。将水滴滴在培养皿盖的边缘2厘米处，再用低倍镜检查，将只有1个担孢子的水滴用蜡笔在反面作标记，并加1滴营养液。为防止培养液过快蒸发，在培养皿内加少许无菌水，用纸包好进行培养。第二天，孢子萌发，经镜检，确认为只有1个芽管，可以在水滴上加一小片琼脂块，以便孢子萌发后继续生长。2～4天后，将菌丝连同琼脂块移到试管内培养。

（4）毛细管切割法将不同稀释度的孢子悬浮液滴入培养皿的琼脂平板上，每个培养皿放1～1.5毫升，停留几分钟后，倒去多余的水，进行保温培养。孢子发芽后，在低倍镜下用毛细管割取只有1个芽管的单孢子，移接到琼脂斜面上培养。

2.多孢分离法按常规方法准备好琼脂平板培养基，用灭菌纱布或滤纸吸去皿盖反面的冷凝水。从杨树菇子实体上剪下一小块菌盖，菌盖下约有6～7片菌褶，再将菌褶的前端和基部剪去，留下的菌褶长约1.5～2厘米，再盖到培养皿上，放到温室培养。6小时后，将培养皿盖按顺时针方向移动若干度（不得小于30度），以后每隔3～4小时按同样方向移动若干度，最后回复到原来位置。然后，移去分离材料，将培养皿放在适温下培养，在平板上会出现不同密度的菌落，挑选分散性较好，且又连接成片的菌落，转入试管内培养。用这种方法，能及时发现混入伞菌孢子内的杂菌。或将一小片菌褶贴附在试管壁上，使孢子直接散落在斜面上。

3.组织分离法选取肉厚、朵大、无病虫害、六七分成熟的子实体作种菇用，已开始弹射孢子的不可作种菇。将选好的种菇用自来水冲洗数次，再用无菌水冲洗数次，然后用无菌纱布或滤纸吸干水分。在接种箱内按无菌操作方法进行组织分离。用手将种菇盖边轻轻撕开，手指不要接触撕开后露出的菌肉部门。将解剖刀在火焰上烧灼灭菌，待冷却后，在菌盖和菌柄或菌盖与幼嫩菌褶连接处挖取一小块（约绿豆粒大小），接种在斜面上。在切取组织块时，不要挖取接近菌盖边缘的部分，以减少杂菌污染。接种时，将组织块准确地接种在斜面的*，切勿在斜面上到处移动，这样便于及时鉴别组织块是否有细菌污染，或当污染出现后便于进行纯化分离。接种后，将斜面置于23～25℃下培养，若组织块上有白色菌丝萌发，并向培养基上蔓延，1～2天后，及时用接种针挑取少量带有菌丝的培养基，接种到空白斜面上进行纯化培养，即可获得杨树菇母种。

组织分离时，组织块附近若出现霉菌污染，因霉菌丝与杨树菇菌丝生长速度相近或更快，故予淘汰。如果组织块附近出现灰白色或黄白色黏状物或水渍样物，则是细菌、酵母菌污染的表现。这时可降低培养温度，抑制污染菌落的生长，当杨树菇菌丝的菌落长到细菌（酵母）菌落之外时，则可采用切割菌落前端的方法进行纯化，也可得到杨树菇的纯培养物。当菌丝长满斜面时，检查培养基的背面，若在杨树菇菌丝的下面出现黄褐色的斑块，则是被菌丝覆盖的细菌（酵母）菌落，可用切割菌丝生长前端的方法再次进行纯化培养，有时这种纯化分离要连续进行多次才能获得纯菌种。这种方法只是一种辅助措施，只有当组织分离的绝大部分斜面都被污染时，才可以采用这种纯化分离法获得母种。

4.出菇鉴定为了检验所分离单孢子菌株是否具有结实能力，出菇特性以及产量水平，对分离物要进行出菇鉴定。此工作可分别在液体培养基和固体培养基上进行。

（1）液体出菇鉴于杨树菇易于在液体培养基中生长，出菇试验可采用液体培养。培养液的组成为：玉米粉25克，豆饼粉10克，葡萄糖10克，硫酸镁1克，磷酸二氧钾2克，蒸馏水（或自来水）1000毫升。将上述培养液分装于1000毫升三角瓶中，每瓶装量200～250毫升，按常规进行高压灭菌备用。

接种后于25℃静置培养，约15天左右，在培养液表面陆续开始分化原基，并形成正常子实体。在25℃有散射光条件下，绝大多数单孢菌株在15～20天均能分化原始，但出菇时间的早晚与产量没有正相关性。出菇早虽然是一个良好的生产性状，但在出菇较晚的菌株中，也可发现出菇密度高，菇潮集中，产量高的优良菌株，这些考核要在固体培养基上进行。

采用液体培养进行出菇试验，不但方法简单，便于观察，且便于比较在同一单位时间内，不同菌株间的生物量（将滤取菌丝用水淋洗干净，与子实体分别置于60℃烘干到恒重，用电子天平称量）。另一特点是在短时间内即可达到出菇试验的目的。

（2）袋式栽培袋栽培养料组成为：阔叶树木屑37%，棉籽壳37%，麦麸20%，玉米粉5%，石膏1%，调含水量为65%。每袋装料300克，于称量后分装于塑料袋中，按常规方法进行高压或常压灭菌备用。

接种后在25℃培养，待菌丝满袋后，将菌袋移至供出菇试验的栽培室内，每个供试菌株一般不得少于20袋，随机排列在床架上，并在同一环境条件下进行栽培管理。待原基分化后，脱去塑料袋，随后进行水分、光照和通风管理。比较其生产性状和产量。