tunel法测定细菌需要加溶菌酶吗

发布网友发布时间：2022-04-25 11:16

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热心网友时间：2024-10-07 04:05

溶菌酶( lysozyme )主要是由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子粘性蛋白，属乙酰多糖酶。存在于唾液、、泪液和鼻及气管等分泌物中，能溶解革兰氏阳性细菌。由于它的高等电点( pH11.0 )，使它能与细菌牢固结合，并水解细菌细胞壁肽聚糖，使细菌裂解死亡。本实验在平板上进行唾液…

溶菌酶( lysozyme )主要是由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子粘性蛋白，属乙酰多糖酶。存在于唾液、、泪液和鼻及气管等分泌物中，能溶解革兰氏阳性细菌。由于它的高等电点( pH11.0 )，使它能与细菌牢固结合，并水解细菌细胞壁肽聚糖，使细菌裂解死亡。

本实验在平板上进行唾液酶的测定。溶菌酶与枯草芽胞杆菌( Bacillus subtilis )作用后，可使该菌因细胞壁破坏而溶解，致使琼脂板加样孔周围出现溶菌环。溶菌环直径与样品中溶菌酶含量的对数呈直线关系。

【材料】

1? 无菌 PBS ( pH6.4 ， 1/15mol/L )， 5mol/LKOH ， 3%PBS 琼脂，溶菌酶标准品，受验者唾液。

2? 枯草芽胞杆菌 12 小时培养物。

3? 10×100 试管，试管架，无菌平皿，打孔器，微量加样器。

4? 分光光度计，水浴箱，温箱等。

【方法】

菌液配制：将 PBS 加入枯草芽胞杆菌斜面，置室温 5-10 分钟后制成菌悬液；在波长 640nm 处，测定菌悬液的浓度，并将菌液浓度调至透光率 30-40% 。

2. 溶菌酶标准液配制：称取溶菌酶标准品，用 PBS 配成 1000 m g/ml ，置冰箱冻存，临用时再稀释成 100 、 50 、 25 和 10 m g/ml 。

3. 收集唾液标本：待检测者用清水漱口后，将唾液收集于消毒平皿内待用。

4. 加热融化 3% 琼脂，冷至 60 -70℃ ，与预热好的枯草芽胞杆菌菌悬液等体积混合，到平板。用打孔器在平板上打孔，孔间距约 1.5cm , 每平板可打孔 8-9 个。

5. 各孔内依次加溶菌酶标准品和唾液样品，每孔 20 m l 。

6. 置于 24 -26 ℃ 12-18 小时后测量溶菌环直径。

【结果判断】

记录溶菌环的直径( mm )于下表，绘制标准曲线，并从标准曲线上查出所测样品的溶菌酶含量。