RACE PCR设计引物都有什么嘛原则和注意事项
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发布时间：2022-04-19 17:42
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时间：2022-04-04 07:22
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点：
1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6 ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
7 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。
8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
RACE PCR设计引物都有什么嘛原则和注意事项
1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机...
RACE PCR引物的设计
在设计RACE PCR引物时，有几点关键因素需要考虑:首先，理想的基因特异性引物（GSPs），通常长度在23到28个核苷酸之间，这样的长度确保了在PCR扩增过程中具有足够的特异性，避免了非目标序列的干扰。其次，GC含量对引物的稳定性至关重要。理想的GSPs应该有50%到70%的GC含量，这样可以保证引物在高温PCR反应...
想请教一下RACE特异性引物的设计
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RACE PCR反应中涉及到的一些事项
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想请教一下做RACE时,特异性引物的设计问题,以及如何根据同源保守区设计...
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请教[选修1]引物问题
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RACE PCR验证基因特异性引物的对照
在进行RACE PCR验证基因特异性引物时，阴性对照是一个关键步骤。首先，仅使用一个特定的引物GSP进行实验，理想的预期结果是不应观察到任何条带。如果检测到产物，应检查循环参数或重新设计引物，以确保其特异性。为了验证目的基因的表达，阳性对照非常重要。当你使用两个GSP（确保它们能产生重叠区域），结合...
英语翻译 及做RACE时的注意事项。
高教有本《现代妃子生物学实验技术》写的比较清楚（目前我看过的书里）注意事项就是要保证RNA的完整,引物要设计好,5‘pcr可能显示没东西,不要担心就用那个接着pcr,同时稀释一下.一般3’一次就能成功,5‘可能要好几次
RACE的原理是什么?它对获得目的基因有何帮助?
楼上说错了。RACE就是在RNA的5‘加上已知序列。这样PCR。一个引物在后加的序列上，另外一个在RNA中间的已知序列上，这样在做RT-PCR，可以得到RNA5’末端的序列
RACE优点
PCR产物的特异性与cDNA合成起始点、引物设计、mRNA量、退火和延伸温度紧密相关。进行5'和3'RACE PCR时应使用热启动。注意引物设计中GC含量、避免自身互补及与AP1互补，以降低回折和形成分子内氢键。利用降落PCR增加RACE PCR产物的特异性，初始循环退火温度高于AP1引物的Tm值，随后调整至AP1温度进行后续循环...
