构建标签蛋白，因为没有内源性抗体，所以就用标签WB检测，怎么都检测不到目的蛋白（跨膜蛋白）

发布网友发布时间：2022-04-30 22:51

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热心网友时间：2023-10-05 20:52

方法一：western　blot　and　strip通过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照406通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化方法二：western　blot　and　immunoprecipitations　通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western　blot分析。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。方法三：in　vitro　ubiquitination　assay将要研究的目的基因转染293细胞waei使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1UbeH13－Uev　1　a　heterodimer　complex　waHA－ubiquitin以及我们要研究的蛋白B（引起蛋白A泛素化的蛋白）62共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。这一方法可以明确引起哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的E3连接酶。方法四：in　vitro　ubiquitin－binding　assay将我们要研究的蛋白（被泛素化的蛋白）基因转染293细胞大量表达后提纯。或者直接提取内源性蛋白。在体外与K63－　or　K48－linked　ubiquitin　chain　petides孵育，然后通过SDS电泳并用泛素化抗体进行检测。这一方法可以明确要研究的蛋白哪个赖氨酸残基容易发生泛素化。