反转录PCR中以第一链cDNA为模板合成第二链PCR时引物该怎么设,还有这个...

引物是热稳定DNA聚合酶的结合位点，能够使子链合成时按照5’—〉3’的方向进行，不设置引物根本就没办法进行互补链的合成，因此尽管只有一条链也应该设置引物。一条模版合成了互补链后，在加热解链后，模板链和互补链均可再做下一次PCR合成的模版，按照指数增长方式快速的合成多个DNA。

首先，当特定mRNA由于含有终止反转录酶的序列而难以完整复制时，可以使用随机六聚体引物。这种非特异性的引物能使所有RNA分子作为cDNA第一链模板，PCR扩增过程中会赋予所需的特异性。然而，用随机六聚体合成的cDNA中，大约96%来源于rRNA，而非目标mRNA。另一种策略是采用Oligo(dT)引物，它专一性地匹配真...

1） cDNA 第一链的合成 用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ...

假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用OligodT引物。使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。随机引物适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。

1. 自身引导合成法首先，通过变性降解去除杂交分子中的RNA，使得单链cDNA的3'端形成发夹结构作为引物。在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，这个引物引导第二链的合成。然而，这种方法存在一些缺点：S1核酸酶在切割发夹结构时，可能导致mRNA 5'端序列出现缺失和重排。此外，如果S1核酸酶纯度不足...

1. 反转录合成cDNA第一链: 利用生物细胞的总mRNA作为模板，反转录酶催化，形成与mRNA互补的RNA-DNA杂交链。mRNA的提取首先通过RNA提取方法，如APGC法或NP-40，确保其完整性。2. cDNA第二链合成: 可通过两种方法，一种是利用cDNA第一链的发夹环作为引物，另一种是RNase H修饰法保留mRNA5'端的顺序。

反转录酶成为了不可或缺的工具酶。反转录的简要步骤是：首先，反转录酶利用dNTP为原料，以RNA为模板，通过tRNA（尤其是色氨酸tRNA）作为引物，从3′端开始合成cDNA，形成RNA-DNA杂交体。接着，RNA链被水解，随后以cDNA为模板合成第二条DNA链，完成整个由RNA指导的DNA合成过程。

在进行RT-PCR合成cDNA的过程中，引物的选择至关重要。首先，对于难以完全拷贝的特定mRNA，可以使用随机六聚体引物。这种非特异性引物让体系中的所有RNA分子都参与cDNA的第一链合成，PCR扩增过程中会赋予所需的特异性。然而，值得注意的是，通常采用随机六聚体合成的cDNA中，约有96%来自rRNA。相比之下，...

• 序列特异性引物:在引物结合位置。用这个系统合成的第一链cDNA可用做PCR*模板。因为cDNA合成和PCR的反应条件是一致的,所以cDNA反应混合物可直接加入PCR混合物。 合成的第一链cDNA也可用做第二链合成的模板。放射标记的DNA 可用做杂交探针。 带3’-poly(A)尾的1.1 kb RNA 作为对照。*PCR过程为Hoffmann-La ...

原理是提取组织或细胞中的总RNA或者mRNA，在反转录酶的作用下将RNA或者mRNA反转录成cDNA，再以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异...