跪求,真的很感谢 ,石蜡切片制作中 ,封片前制好的切片需要再次脱水吗。为...
发布网友
发布时间：2022-05-01 19:03
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时间：2022-07-15 05:31
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时间：2022-07-15 02:39
切片一系列工作完成后，就要进行染色和封片了。由于要染色的切片尚包在石蜡中，而所用的染色液都为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水。与固定的组织块脱水、透明的步骤相反，石蜡切片先在二甲苯中溶去石蜡，再经过各级酒精，下行至水。
染色后，如果组织片中有水分，则光不宜通透，在显微镜下观察不清组织的结构，所以必须经过脱水。
给你我们学校的实验讲义看看吧～希望对你有帮助～有不懂的地方问我～
实验一 石蜡包埋切片技术
实验目的：1、学习石蜡包埋切片技术的基本原理和基本步骤；
2、掌握石蜡包埋切片技术。
实验原理：
大家在生物学实验时，曾经观察过动物组织和植物组织的切片。通过光学显微镜，我们可以观察到细胞内部的结构（例如细胞核、细胞质、肌肉组织的横纹等）、细胞相互间的联系以及组织的构成等。那么，如何来制作这种切片呢？其过程是比较复杂的，我们利用3—4次实验来学习组织切片的制作。
大家知道，我们要在显微镜下研究生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察的，因为整个动、植物体大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，一定要经过特殊的处理，使要观察的材料先减少它的厚度和体积，使光线能透过才能用显微镜观察。通常应用的有两种方法：一种是非切片法，即用物理或化学的方法将生物体组织分离成为单个细胞或薄片，例如我们在生物学实验曾做过口腔上皮的观察、洋葱鳞茎表皮的观察。这种方法的不足之处在于细胞彼此间相互的联系不一定观察到。另外一种为切片法，即用刀将标本切成薄片。
非切片法比较简单，一学就会，我们这里不作介绍。
切片法也分徒手切片法和切片机切片法。最简单的切片法是将新鲜植物材料直接用刀切成薄片，称之为徒手切片法。切片机切片法是用特殊的切片机来切片，切片的厚度可薄到几个微米。因此，切片机的发明与应用也是细胞学诞生的重要因素。
切片机切组织用的也是刀（切片刀），所要切的组织要有一定的软硬度，如刀切肉（新鲜、冷冻）。但大部分生物材料比较柔软，所以为了能切出薄片，必须先使所切材料有一定的软硬度。一些包埋剂可以达到这个目的，如石蜡，它融化时可渗入到组织内部；凝固时，使整个组织有一定的软硬度，正好能切出很薄的切片，故称为石蜡包埋切片法。另外还有火棉胶包埋切片法（火棉胶做包埋剂）、冰冻切片法（使组织冷冻到一定的硬度）等。其中最常用的切片方法还是石蜡包埋切片法，我们这里重点学习石蜡包埋切片技术。
实验器材：
（一）小鼠、小广口瓶、标签、量筒、烧杯、95%酒精、无水酒精、蒸馏水、手术刀、剪刀、镊子、平皿、石蜡块、滤纸、甲醛液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。
（二）恒温箱、融蜡、纸盒、烫板、支架、酒精灯、火柴、小镊子、滤纸。（擦载玻片、磨刀、液体石蜡）。
（三）手术刀、木板、酒精灯、火柴、锯条、木块、塑料板、切片刀、切片机、毛笔、小镊子、载玻片、蛋白甘油、恒温水浴箱、温度计、大白盘。
实验步骤：
制作小鼠肝、脾、肾、小肠等切片。
1、取材：取材是指从动物或植物体上割取所要观察的组织材料，比如植物的茎、叶，动物的肝脏、小肠等。
取材时应注意以下几点：
（1）新鲜：在割取材料时应愈快愈好，否则动植物体的细胞成分、结构及分布等就会发生改变。
（2）防止人为损伤：如生拉硬拽、挤压等，以免出现人为损伤。
（3）大小：0.5 cm × 0.5 cm × 0.2cm。
2、固定：机体死亡或组织离体后，组织细胞由于血液供应停止，即可发生缺氧，导致生物氧化过程停止。相反，细胞内的无氧酵解酶类活跃，使组织内蛋白质、糖、脂肪降解，导致组织发生自溶。另外，组织也可因污染细菌而发生*。因此，为了使细胞和组织结构保持生活时的状态，必须进行适当的固定。固定的目的在于保存组织内细胞的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。
固定组织的物质——固定剂——具有凝固或沉淀组织蛋白的作用，因此能抑制酵解酶类的活动和细菌的繁殖，从而呈现对组织的固定作用。
固定剂的种类很多，最常见的有乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞和锇酸等8种。各种固定剂对蛋白质、脂肪、糖等作用不同，因此，单一的固定剂不能保存所有的成分，故多用混合固定剂。
各种书籍对固定剂的介绍特别多，如化学性质、固定的原理、固定组织的优缺点等，由于时间的所限，我们这里不作详细介绍，仅介绍几种常见的固定液及其配方和用途。
（1）10%*液：1份甲醛液 + 9份蒸馏水
市场上出售的甲醛液约含37-40%的甲醛，10%*液实际上仅含3.7-4.0%的甲醛。
适用范围：各种组织。但是经10%*液固定的组织，细胞核染色较好，而细胞质染色较差。
处理：组织块一般固定16-24h，长时间亦可，甚至可用来长期保存组织块。短时间固定的组织块不需水洗，可直接转入70%酒精脱水。
（2）Bouin氏液：苦味酸饱和水溶液（1.22%） 75ml （15）
甲醛液 25ml （5）
冰醋酸 5ml （1）
适用范围：各种动物组织及植物组织的根尖，是动物组织良好的固定液。
处理：固定24h，也可在此液长期保存。流水冲洗或不经水洗直接入70%酒精脱水。
（3）Zenker氏液： 甲液：氯化汞（升汞） 5g
重铬酸钾 2.5g
硫酸钠 1g
蒸馏水 100ml
乙液：冰醋酸 5ml
使用前将甲、乙两液混合。
适用范围:为一般动物组织的优良固定液，经其固定的组织，细胞核及细胞质染色颇为清晰。
处理：固定时间为16-24h，然后流水冲洗一夜以洗去氯化汞，再入70%酒精脱水。切片染色前要用碘液除去汞沉淀。
（4）Gendre氏液： 苦味酸饱和酒*（8.96g/100ml95%酒精） 85ml
甲醛液 10ml
冰醋酸 5ml
适用范围：用于检查动物组织中的糖原（因为糖原溶于水）。
处理：固定3-6h，直接转入95%酒精脱水。
（5）Carnoy氏液： 无水乙醇 60ml
三氯甲烷 30ml
冰醋酸 10ml
适用范围：用于检查动物组织的核酸、糖原等。
处理：固定2-6h，直接转入95%酒精脱水。
还有多种多样的其它固定液。固定液的选择应根据所要固定的材料以及检查的目的而定。
3、冲洗：材料自固定液中取出后，需立即冲洗，使其中所有的固定液全部除去，以妨碍染色。
有些固定液，如10%*液、Bouin氏液固定的材料，若时间较短的话可不必冲洗。但时间过长亦需冲洗。
冲洗的方法：组织块放在瓶内，胶管插入瓶内接通自来水，瓶口用纱布包住。流水冲洗一夜，即能达到冲洗的目的。
4、脱水：脱水的目的在于使组织中的水分完全除去。因为组织块将来要在石蜡
中包埋，而水和石蜡是不相溶的。必须经过脱水后，才能进入包埋阶段。
常用的脱水剂有乙醇、丙酮、正丁醇等，最常用的还是乙醇。利用脱水剂吸水的特性，在各级浓度脱水剂中逐渐吸取组织中的水分。乙醇脱水的过程一般从70%乙醇开始，经80%、90%、95%、100%（二次）而完成脱水过程。每向后转移前，须先将组织块上的液体用吸水纸吸干，以免影响后续乙醇的浓度。
脱水时应注意：（1）在高浓度或无水乙醇中，每级停留的时间不宜太长，否则可使组织收缩变脆，影响切片；（2）如需过夜，应停留在70%乙醇中，也可长期保存，可防止因时间倒不开而影响后续步骤。
5、透明：脱水后是否可以进入包埋呢？但因脱水剂与石蜡也不相溶，因此在包
埋前，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于石蜡的物质——透明剂——来起中间置
换作用。
所以，透明的目的在于使组织中的乙醇或丙酮被透明剂所代替，以使石蜡能很顺利地进入组织中。另外，还能增强组织的折光系数，故称透明剂。
透明剂的种类很多，常用的有二甲苯、甲苯、苯等。二甲苯为最常用的透明剂，二甲苯能溶于醇及醚，亦为石蜡溶剂，但不溶于水，它的透明力很强。
透明过程：一般经过1/2二甲苯-1/2无水乙醇，两次二甲苯。
透明彻底的标准：胃、肠、结缔组织等比较透明；肝、肾、心、肌肉等组织呈暗红色浸油状态，则说明脱水、透明良好。如果组织进入二甲苯30min以后还不变色，或中心有白色，说明水分未脱净，应返回无水乙醇继续脱水。透明这一步至关重要，若透明时间不足，则石蜡进不去，不能切片；若透明时间过长，则使组织收缩变脆、变硬，切片易碎。这一步要靠经验。
6、浸蜡：浸蜡就是将石蜡透入整个组织的过程。
所谓石蜡包埋切片法，是用石蜡来浸透、包埋组织块，再进行切片和染色的
制片方法。
石蜡为最常用的包埋剂，有几种不同熔点的石蜡，通常所用的石蜡的熔点为54-58℃。
浸蜡过程：在60℃的温箱内已融化的石蜡中经两次各1h，使石蜡浸透组织。
浸蜡时注意温度不宜过高，浸蜡时间亦不宜过长，否则会引起组织变硬、变脆，影响切片。
7、包埋：包埋就是被石蜡浸透的组织连同溶化的石蜡，一起倒入一定形状的器皿（如纸盒、平皿）中，然后使其凝固成蜡块的过程。
包埋的过程：（1）折叠纸盒；
（2）用酒精灯加热温台及纸盒；
（3）往纸盒中倒入溶化的石蜡；
（4）放入组织块，切面向下，并拨正位置；
（5）蜡块凝固。
从取材到包埋是一个连续的过程，往往连续几天，如果没有计划、没有完善的安排，就有可能和其他上课时间发生冲突，或造成半夜出勤。有时单凭记忆，把前后顺序颠倒或超过了规定时间，会造成实验失败。因此需预先编制一个日程表。
【建议时间】
乙醇脱水：70%：16：30
80%：第二天7：20
90%：9：20
95%：11：00
100%(Ⅰ):12:00
100%(Ⅱ):13:00
透明：1/2二甲苯-1/2无水乙醇：14：00
二甲苯（Ⅰ）：14：20
二甲苯（Ⅱ）：14：40
浸蜡：石蜡（Ⅰ）：15：00
石蜡（Ⅱ）：16：00
包埋：17：00
注意事项：（1）动作要迅速；（2）融蜡别滴到桌面、地上。
8、切片：在包埋后，就可以进行切片。在切片之前，还需对包埋好的组织块进行修整，并贴附于木块上，才能进行切片。
修块：以每一组织块为单位，用小刀将组织块大体修成长方形或梯形，组织的周围须留1-2mm宽的蜡边。
固着：用酒精灯烧热金属片，将组织块切面的对立面稍烫熔一下，并立即贴于木块上。
切片机的构造：
切片机是用来做各种组织切片的一种仪器，其样式很多，性能也不一样，一般可分为两大类型，即滑行式切片机与旋转式切片机。我们使用的是旋转式切片机。其主要结构分为3部分：（1）控制切片厚度的微动装置；（2）供装置切片刀的夹刀部分；（3）供装置组织块的夹物部分。旋转轮每旋转一次，微动装置就按所调节好的切片厚度以水平方向将组织块向前推进一片的厚度。
切片操作：
（1）固定切片刀：刀刃向上，保持水平。调好角度，一般在4-6度。
（2）固定组织块。
（3）调整所需要的切片厚度：一般在6-10微米。
（4）移动持刀器，或拔开齿轮上的牵引钩，前后转动齿轮以移动组织块固定器，调节组织块表面和刀刃的距离，以刚要接近时为止。
（5）调整组织块与刀刃之间的角度和位置：组织块的切面及上下边须与刀刃平行。
（6）粗切：右手摇轮，左手转动齿轮，慢慢将组织块切到组织本身。
（7）切片：右手转动摇轮，转一圈可切下一片，切第二片与第一片连在一起，即成连续切片。左手用镊子或毛笔提起切片的下端，轻轻向自身方向拽，使切片成连续的带状。
（8）展片：停止切片，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带跳起，靠刀刃的一面向下，慢慢接触40-45℃的水面，借助水的表面张力使其在水面展开。如有小的皱褶，用小镊子轻轻分开。应注意：水温过高，易使切片全部融化；水温过低，切片不宜伸展。
（9）贴片：即将切片贴在载玻片上。先将连续切片分成一片或小段。将载玻片1/2处均匀涂一层薄薄的蛋白甘油（等量的鸡蛋清和甘油混合而成，防止脱片。切勿涂得过多！），将载玻片垂直插入水中，以涂有蛋白甘油的面贴近组织片，提起载玻片使组织片贴附在载玻片上。用小镊子将切片摆在载玻片1/3和2/3的交界处，并摆正位置。然后在52-60℃恒温箱烤干。
整个石蜡包埋切片技术至此全部结束。
实验二 苏木精-伊红染色
实验目的：1、了解染色的基本原理和基本方法；
2、掌握苏木精-伊红染色方法。
实验原理：
一、染料的一般知识
1、染料的染色原理：（1）化学作用：染料的性质有酸、碱、中性之别，那么组织中的碱性部分（如细胞质）易和酸性染料亲和而发生作用，组织中的酸性部分（如染色质）易和碱性染料亲和而发生作用。（2）物理作用：指吸附或溶解作用。组织蛋白和某些染料有相互吸附的作用。
2、媒染剂、促染剂和分化剂
媒染剂：某些天然染料（如苏木精），本身无着色性，要与其他物质结合后才具有着色性，这些被结合的物质称为媒染剂，如许多铁盐、铬盐及钾盐等。
促染剂：是促进染料着色性的物质，如冰醋酸是伊红的促染剂。
分化剂：能使切片上需要显示的结构清晰，而使不需要显示的结构脱去颜色的物质。如1%盐酸酒精。
一、苏木精-伊红染色（H.E染色）
所做出的石蜡包埋切片可应用的染色方法很多，应根据不同的检查目的而选用不同的染色方法。而最为常用的染色法为H.E染色。
1、苏木精(苏木素、苏木紫)（hematoxylin）：为从苏木中提取。苏木精本身不是染料，不能直接染色，必须经氧化才能染色。可以在空气中自然氧化，但需时很长，所以一般都是加氧化剂（如碘酸钠）氧化。同时，被染材料又须经媒染剂作用后才有着色能力，所以在配制苏木精染液时，都加有媒染剂。苏木*主要着染细胞核。
有数种不同配方的苏木*。
Mayer(梅耶)氏苏木*：
苏木素 1g
硫酸铝钾 50g （媒染剂)
碘酸钠 0.2g
水合氯醛 50g
柠檬酸 1g
蒸馏水 1000ml
2、伊红（曙红）(eosin)：又分几种，如伊红Y、伊红B等。
伊红对细胞质、肌纤维、胶原纤维具有着色性。
一般用0.5%伊红/70%乙醇液或1%伊红水溶液。
由于苏木精着染细胞核，伊红着染细胞质，所以这种方法称为双重对比染色法。
实验材料：石蜡切片、盖玻片、小镊子、大镊子、树胶、滤纸、纱布、染色缸、二甲苯、乙醇系列、Mayer氏苏木*、0.5%伊红酒*（或1%伊红水溶液）、1%盐酸酒精、蒸馏水、显微镜。
实验步骤：
1、切片脱蜡、复水：
由于要染色的切片尚包在石蜡之中，而所用的染色液都为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水。与固定的组织块脱水、透明的步骤相反，石蜡切片先在二甲苯中溶去石蜡，再经过各级酒精，下行至水。
把玻片放入盛有二甲苯的染色缸中以溶去石蜡（20min），再经第二缸二甲苯（10min）。经100%、95%、90%、80%、70%各级酒精、蒸馏水入水，每级3-5min。
2、入苏木*染5-7min。
3、流水洗去附着染液，（在1%盐酸酒精中蘸3-4下），然后流水冲洗20min使切片由淡红色变为灰兰色。
4、入伊红染液5-7min。
5、脱水、透明：
如果组织片中有水分，则光不宜通透，在显微镜下观察不清组织的结构，所以必须经过脱水。透明剂能增强组织的折光系数。这样，才能在显微镜下观察。
在70%、80%、90%的酒精中每级各蘸3—4下，再经95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精，每级各5min。在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中分别透明10min。
6、封片：
从二甲苯中取出载玻片，未等二甲苯挥发，在组织切片上滴加适量树胶，上面再加盖玻片（倾斜放下）封固。
封片目的：（1）便于保存；（2）应用合适折光率的封藏剂使组织结构能在镜下很清晰地显示出来。
结果：细胞核呈蓝色至深蓝色，细胞质呈淡红色或红色。
作业：1、为什么生物体的组织要经过如此繁琐的步骤才能观察其组织结构？
2、查阅文献，有哪些文章采用石蜡包埋切片和H.E.染色？
3、通过查阅文献，谈一下石蜡包埋切片和H.E.染色的用途。
