糖化血红蛋白检测金标准方法

发布网友发布时间：2024-07-10 05:01

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热心网友时间：2024-07-16 12:04

1、阳离子交换色谱法：该方法基于糖化作用导致血红蛋白分子表面阳离子丢失的原理。在弱阳离子交换剂如Biorex70中，随着离子浓度增加和（或）pH降低，糖化血红蛋白会在非糖化血红蛋白之前被洗脱，这一现象使得糖化血红蛋白得到了“快速血红蛋白”的最初称呼。阳离子交换色谱法适用于小型、微型或大型柱层析方法，以及部分或全自动的PHLC/FPLC方法。然而，由于其他翻译后修饰的血红蛋白，如醛亚胺型、甲酰化、乙酰化、乙醛加合物、降解物、老化人工物品和异常血红蛋白电荷交换，它们与正常HbA0的性质不同，因此在阳离子交换层析法中可能会产生干扰。尽管如此，使用常规HPLC方法可以分离糖化血红蛋白亚组分，并且能够在临床所需的 precision范围内达到分离效果。但是，HbA1c的峰并不均一，而是包含一个重要的非糖化血红蛋白部分。部分糖化血红蛋白也整合到HbA0主峰中。通过使用特殊的柱材料（poly-CATA）和30～40分钟的分离时间，可以改善分离效果。这些方法可以作为参考步骤，但不适合常规使用。所有阳离子交换色谱法对pH和温度的变化都很敏感，因此需要控制pH和温度。
2、电泳法：电泳法的分离基础是糖化血红蛋白总电荷的变化和等电点的变化。琼脂糖凝胶电泳的血红蛋白亚组分分辨率较低，而等电聚焦电泳可以更好地分离亚组分。由于自动化程度不足，电泳法的重要性已经降低。
3、亲和层析法：该法基于硼酸与顺式-羟基的结合。商品化的m-氨基苯硼酸琼脂糖共价结合的亲和柱可用于微柱租仔者分析检测。将血样本中的血红蛋白加入层析柱后，所有的糖化血红蛋白（HbA1和旁链糖化的血红蛋白；总糖化血红蛋白）与硼酸结合，而非糖化血红蛋白通过层析柱可被测量。在加入高浓度也包含顺式-羟基的多羟基复合物，如山梨醇后，糖化血红蛋白与硼酸的结合被替换而从柱子上洗脱下来。亲和层析法对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感。利用亲和层析法，仅能测定总糖化血红蛋白。广泛使用的亲和层析方法，允许用经验算法从总糖化血红蛋白值计算出“标准的HbA1c”。
4、免疫分析法：该法利用缬氨酸β-N-末端糖化的血红蛋白提供一个容易被抗体识别的抗原表位。可以使用单克隆抗体或多克隆抗体进行放射免疫分析和免疫酶学分析测定，抗体特异性识别β链N-末端糖化的血红蛋白最后4～8个氨基酸组成的抗原表位。异常的血红蛋白或翻译后修饰的血红蛋白不会产生干扰。目前的免疫化学试验不仅检测HbA1c，通常也同时检测HbA2c，因为血红蛋白A2糖化δ链的表位是相同的。抗体直接抗β-链的最后四个氨基酸的糖化表位的免疫化学试验也可用于检测，例如HbS1c。在大多数情况下HbA2c意义不大，尽管在镰刀细胞病时可以准确地测定缬氨酸β-N-氨基末端糖化程度，但它仍不能100%代表HbA1c。
5、离子层析法：该法操作简单、精密度高、重复性好，被临床广泛采用。检测原理基于血红蛋白β-链N末端缬氨酸糖化后所带电荷不同，在偏酸溶液中总糖化血红蛋白(GHb)及HbA均具有阳离子的特性，因此经过阳离子交换层析柱时可被偏酸的缓冲液平衡过的树脂来吸附，但二者吸附率不同，GHb正电荷较少吸附率较低，HbA正电荷较多吸附率较高。用不同pH的磷酸盐缓冲液可以分次洗脱出GHb和HbA，用KCN可将Hb转化为高铁氰化血红蛋白，用分光光度计测定。或者得到相应的Hb层析谱，其横坐标是时间，纵坐标是百分比。HbA1c值以百分率来表示。现在大部分都用全自动测定仪测定。
6、等电点聚集法：这是测定GHb的新技术。在聚丙烯酞凝胶中加入载体两性介质的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH梯度，溶血液中各个组份将移动到各自的等电点的pH位置上，从而得到比一般电泳法更好的分划效果和比较集中的色带。通过分辨率高的微量光密度仪扫描，可以准确地测定出各自组份的含量。由于它能够分辨出一级结构不同的HbA、HbAc、HbF、HbS及HbC等，可以完全避开各种物质的干扰。
7、化学发光法：采用离子捕捉免疫分析法，应用抗原抗体反应原理，联以荧光标记物，通过连接带负电的多阴离子复合物，吸附到带正电的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变化率，计算浓度。采用专用试剂包和免疫发光分析仪，其检测系统易于规范和重复，可减少操作技术误差，检测的灵敏度和特异性高，批内、批间变异系数小，回收率高，准确度高，交叉污染率小，影响因素少。
8、酶法：该法的原理为用特殊蛋白酶分解Hb，3~5分钟内果糖基氨基酸从Hb分离，果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)从果糖基氨基酸产生H2O2，H2O2经POD与DA-64反应，选择751 nm测吸光度改变求得GHb浓度。