如何保证引物3'端正确性

发布网友发布时间：2024-05-07 12:05

共3个回答

热心网友时间：2024-06-07 23:14

使设计引物吗？是的话下面就是答案
【1】引物的长度以15－30bp为宜，否则会影响扩增的特异性。
【2】碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的G+C含量在40％－60％之间，若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在5'端加上一些A或T。
【3】应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的3'端互补形成引物二聚体，避免在引物的3'端有3个G或3个C成串排列，3'端的末位碱基最好选T、C、G,而不选A，也有建议在引物的两端用1－2个嘌呤碱基。
【4】尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃），退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。（注：对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的附加序列是不与模板链结合的，而在后来的PCR反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。）
【5】引物的3’端要与模板严格配对，而5’端碱基没有严格的限制，只要与模板DNA结合的部分足够长，其5’端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态，这样，我们可以在引物的5末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。
【6】不要在扩增序列的二级结构区设计引物，以免退火困难。也要考虑引物设计处模板的特异性。

热心网友时间：2024-06-07 23:12

在保守区设计引物，然后扩增后测序便知~
话说回来，所谓正确性是个啥标准捏~

热心网友时间：2024-06-07 23:14

设计引物时候保证3‘端完全匹配就可以了。不过物种间可能有不同的变异。可以采用设计简并引物