求求。。。进行蛋白质分离纯化前,小试管预实验法具体步骤???望...

发布网友发布时间：2024-03-08 19:15

共2个回答

热心网友时间：2024-03-14 15:24

既然是小“试管”，应该是原核表达吧，一般多用lacZ启动子来诱导表达，你没多说，我就按这个步骤来说：
1，检测表达蛋白的可溶性：用新鲜菌种接种5ml或10ml摇菌，先37℃摇，3小时后诱导3h（这个温度和时间有文献参考是最好的），收菌体，用pbs洗2遍，再1mlPBS悬浮，破菌（超声，或加溶菌酶，或试剂盒之类的），12000rpm离心20min，分别收集上清和沉淀。用1ml的pbs重悬沉淀，加SDS-PAGE的loading buffer至1X，沸煮5min，同时量上清也加loading煮沸，取适量上清和沉淀上样跑SDS-page，看蛋白在上清和沉淀中的分布，一般选择分布较多的做后续纯化；如果上清中的量即使较少，但也够用，优先选择纯化上清中的蛋白，因为是可溶性的，而沉淀中的是包涵体，会比较麻烦；
2，优化表达条件，这就要做多组对照时间，检验合适的表达温度（这一步往往需要和1结合进行，有时37℃的包涵体在较低温度下可能表现为可溶），扩菌时间和诱导时间。
基本如此吧，若有疑问，欢迎继续讨论，祝实验顺利！

热心网友时间：2024-03-14 15:27

根据你那个蛋白的性质分离，常用有疏水、离子交换、分子筛