如何设计引物进行扩增?
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发布时间：2024-01-14 10:34
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时间：2024-01-19 13:53
① 特异性：引物应在保守区内设计并具有特异性，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
② 引物长度：一般在15~30碱基之间，引物有效长度Ln=2(G+C)+A+T，Ln值不能大于38。（Ln>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度74℃，不能保证产物的特异性）
③ 目的片段二级结构：要扩增的片段单链不能形成二级结构，扩增片段长度为100~600碱基对。
④ 引物二级结构：引物自身连续互补碱基不能多于3bp，一对引物间连续碱基的同源性或互补性不能多于4bp。
⑤ 引物的5′端：可以被修饰而不影响扩增的特异性。5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点；插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。
⑥ 引物的3′端：绝对不能进行任何修饰，3′端也不能有形成任何二级结构的可能，引物3′端不要终止于密码子的第3位。
⑦ TM值：按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为50~70℃。尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过 2℃。若引物中的 G+C 含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。退火温度约为TM-4。
⑧ GC含量：G+C含量在40%~60%之间。四种碱基的分布最好随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。
