5 mmol/L柠檬酸钠(pH7.0), 10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、0.5% S...

发布网友发布时间：2024-01-12 00:37

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热心网友时间：2024-03-11 07:24

（一）1.取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉2.加入4mL提取液，快速振荡混匀3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）4.1000rpm，4℃，5min5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000rpm，4℃离心5min）6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中8.加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1hr9.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）10.取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc（二）1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉2.加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次3．加入1mL5MKAc，冰浴20min4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500LTE中7．加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1hr8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）9．取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。