CircRNA免疫共沉淀实验的流程介绍?

发布网友发布时间：2023-12-16 04:27

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热心网友时间：2024-08-18 06:20

CircRNA免疫共沉淀（circRNA immunoprecipitation，circRIP）实验是一种用于研究环状RNA与其相互作用蛋白之间关系的常用实验方法。以下是circRNA免疫共沉淀实验的一般流程：

细胞培养：选择适当的细胞系，并在培养皿中培养至适当的密度。

细胞处理：根据需要，在细胞培养基中加入适当的处理剂，如药物、激素等，处理细胞一段时间，以诱导或抑制circRNA的表达。

细胞收集：将处理后的细胞用冷PBS洗涤数次，然后使用细胞刮板刮下细胞，并通过离心将细胞沉淀下来。

细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶抑制剂）裂解细胞，破坏细胞膜和核膜，释放细胞内的细胞质和核糖体。

免疫共沉淀：将裂解后的细胞提取物与特异性circRNA抗体预先结合，形成免疫复合物。通过旋转或摇床等方式，将免疫复合物与蛋白A/G琼脂糖磁珠（或亲和剂）结合，使抗体与目标circRNA结合的复合物以及相关的蛋白一同结合到琼脂糖磁珠上。

洗涤：使用洗涤缓冲液洗涤琼脂糖磁珠，去除非特异性结合的细胞蛋白。

土豆酶处理：使用土豆酶处理溶液，将环状RNA解除线性化。这样可以避免在后续的分析中引入circRNA的序列偏差。

纯化：将琼脂糖磁珠与结合的免疫复合物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白。

RNA提取：使用适当的方法从琼脂糖磁珠上纯化circRNA。

分析：提取的circRNA可进行进一步的实验分析，如逆转录-聚合酶链式反应RT-PCR、实时定量PCR、高通量测序等。

以上流程仅为一般参考，具体实验步骤可能因研究目的、细胞类型等而有所不同。在进行circRNA免疫共沉淀实验时，还需严格遵守实验室的安全操作规程，并根据实验目的选择相应的阳性/阴性对照组和技术控制组进行验证。